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参附注射液抗心源性休克的作用机制研究

来源:论文帮手 作者: 发布日期:2017-12-09 11:43:25

 引  言

 
    心源性休克是由于心功能不全,导致泵衰竭,使周边组织处于低灌流状态、血流动力学异常,从而诱发休克。急性心肌梗死( Acute myocardial infarction,AMI)是心源性休克最常见的原因,而心源性休克是 AMI住院患者的主要死因。[1]根据心源性休克发生发展过程可分为早、中、晚期,早期在临床上的血流动力学指标表现为:血压正常甚至轻度增高或稍降,心率加快,脉压差变小;中期血流动力学参数表现为:血压下降幅度明显,心率比早期时增快,脉压差比早期进一步变小;晚期则会出现弥散性血管内凝血和多器官功能衰竭的症状。心源性休克的临床治疗提倡尽早发现高危患者,尽快实施有效的治疗措施,探讨对心源性休克早、中期的干预作用及机制显得尤为重要。根据心源性休克的临床表现,可归属于中医学心悸、胸痹、喘证、痰饮、水肿等范畴[2]。
参附注射液 ( Shenfu Injection,SFI) 源自《校注妇人良方•卷九》之参附汤,由红参、附子经现代工艺加工制备而成,主要成分为人参皂苷与乌头类生物碱[3]。红参可大补元气、益气摄血、复脉固脱; 附子可回阳救逆、补火助阳、散寒止痛,二者合用具有益气温阳、温通心脉、回阳救逆、益气固脱等多重功效。
当代药理研究也证明附子具有正性肌力、抗心律失常、舒张血管、调节免疫等多种药理作用[4,5],而人参也具有对心肌细胞的保护作用及抗心力衰竭作用[6,7],若附子与人参配伍,能改善血流动力学相关指标,有增强治疗或缓解急性心力衰竭的作用[8]。且诸多研究表明,在治疗心力衰竭患者过程中,仅仅给予西医基础治疗是不够完美的,还要联合运用参附注射液振心肾之阳,除阴寒之气,达到改善患者机体平衡,提高生活质量的效果[9,10]。参附注射液近年来被广泛用于治疗心力衰竭、休克、心律失常、急性心肌梗死、病毒性心肌炎、肺心病等心血管疾病,疗效显著[11,12]。因而,参附注射液治疗心血管系统疾病的药理作用机制研究亦受到广泛关注[13,14]。
目前,中医药研究忽视了中医药和西医学对疾病认识的不同,遵循的大多是西方医学理论,如选择单一的病理、生理、生化指标进行研究,很难诠释中药复方作用机制,在中医药的研究中难以取得突破性的进展[15]。中药作用机制的研究大多是沿用化学药物分析的思路,而忽略了中药复方作用的最基本特征是“整体大于部分之和”。中药复方的作用机制研究理应在中医基础理论指导下,结合中医理论的核心观念---整体观,探讨中医疾病证侯发生发展的物质基础和动态变化过程[16]。
代谢组学立足于系统整体效应角度,通过对生物体内内源性代谢物种类及数量变化的分析,获取体内动态代谢变化的综合信息来了解其可能受影响的部位和环节,进而确定机体内部生物学变化过程,应用全面性系统策略理解疾病过程和机制[17,18]。另外代谢组学在方法学上具有无创、在体、动态等特点,与中医学整体动态性原则一致;且代谢组学应用的新技术都可以达到精细检测的水平,可以从微观上解读中医学证候的关键问题[19]。近年来,代谢组学发展迅速,在中医药研究领域应用广泛,为中医药研究提供了创新性思路和良好的研究平台。
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
正  文
第一章 国内代谢组学研究计量学分析
 
代谢组学是后基因组学时代最重要的组学技术之一,也是最重要的系统生物学技术。主要是应用现代分析技术结合化学信息学分析方法表征或揭示生物体在特定时间和环境下的整体功能状态。主要研究思想是“全局观点”,强调把人或动物作为一个整体来研究,同时在方法学上具有无创伤、动态、接近生理条件下研究等特点,在医药、临床、中药等研究领域得到了广泛应用[20-21]。
文献计量学分析用数学和统计学的方法,定量地分析一切知识载体的交叉科学。应用文献计量学方法研究某一学科或领域的文献计量学特征,有利于本领域和学科的发展规律发现。CiteSpace 是一款可视化文献分析软件,通过对学术文献中的关键词、作者、共引文献等字段的分析,找出其中的关系,并可视化表示出来,常用于分析一个学科或知识域在一定时期发展的趋势与动向。
本文基于CNKI医药卫生文献数据库,应用文献计量学软件 CiteSpace III 分析代谢组学在医药研究领域的文献计量学特征,通过绘制作者、研究机构、关键词和突现词的知识图谱,分析代谢组学在医药研究领域的研究重点和研究热点,探索代谢组学在医药领域研究的应用规律及其在不同研究前沿间的内部联系,为代谢组学研究人员提供参考。
1数据来源与方法
1.1数据来源
    本文所使用的数据皆来源于中国知网医药卫生科技数据库,期刊来源:SCI,核心期刊;研究层次:基础与应用基础研究,工程技术;主题词:代谢组学;检索时段:2005年1月至2014年12月。
1.2纳入与排除标准
    同时符合如下条件:① 纳入以代谢组学为主题的文献,排除非该主题文献。② 排除综述型文献。③ 纳入文献的类型为期刊文章,排除新闻、 会议通知、 文摘、 书籍 、会议论文、学位论文等类型文献。④ 纳入的文献需有足够信息摘要且可获得全文,排除资料缺失不能获取全文的文献。⑤ 排除重复文献。
1.3分析方法
    本文运用图书馆领域文献计量学的方法,通过绘制科学图谱来展示救援医学的研究力量分布、研究热点以及前沿趋势。研究采用著名信息可视化专家美国Drexel大学信息科学与技术学院陈超美博士,基于Java语言研发的CiteSpace III软件作为知识图谱可视化工具[22]。通过CiteSpace III软件绘制代谢组学应用于医药研究的知识图谱,用视图来反映知识领域在一定时期内发展的重要研究力量,通过展示的结果对于领域内的专家所发表的有代表性的论文进行深入分析,通过对关键词和名词短语词的视图分布来研究代谢组学领域的研究热点。 
1.4软件设备
GraphPad Prism 5 ;CiteSpace III
2结果 
    通过主题词检索检出文献数量为759篇,按 “1.2 ”标准对检出文献进一步筛选,共有 475篇文献纳入本次文献分析。 
2.1 文献年度分析 
文献的年度分布情况,分析文献量与时间变化的关系,可以反映研究主题在该领域的发展情况,揭示该主题的发展阶段与规律[23]。本实验以时间为X轴,以每年的文献发表文献数量为Y轴,绘制代谢组学文献年度分布图(图1-1)。文献年度分布图显示,2005年起发文量总体逐年上升,2014年达到顶峰 96篇,结果表明在医药研究领域以代谢组学为主题词的应用文献不断增加,表明代谢组学是在医药卫生领域的中药研究方法,在医药研究中具有广泛的应用价值。
 
图1-1 代谢组学研究文献年度分布图
Fig.1-1 The annual distribution of metabolic research literature
 
2.2研究机构分析
将网络节点(Node Types)设置为机构(Institution),时间间隔(Time slice)为2 years,Top N per slice为20,算法选择Pathfinder,其余参数均为默认值,通过CiteSpaceIII软件绘制出各机构被引聚焦图(图1-2)。图中节点代表机构,节点的大小以文献中机构出现的频率控制,出现的频率次数越多,节点越大。分析得到的结果显示被引频次居于前10的分别为山西大学中医药现代研究中(20)、山西大学化学化工学院(18)、广东药学院中药学院(13)、国家生物医学分析中心(13)、中国药科大学药物代谢动力学重点实验室(10)、南方医科大学中医药学院(10)、中国科学院大连化学物理研究所(9)、江西中医学院现代中药制剂教育部重点实验室(9)、北京中医药大学基础医学院(8)、新疆医科大学药学院(8),见表1-1。由图可知,广东药学院中药学院与广州中医药大学中药学院、清华大学化学系、清华大学分析中心、华东理工大学药学院之间有密切的合作关系,且总体被引频次较大;北京中医药大学基础医学院与军事医学科学院毒物药物研究所、首都师范大学化学系、国家北京药物安全评价研究中心也存在合作关系,但线条较细,共被引次数较少;其他研究机构间相互合作较少,少数仅是校内合作,如山西大学。值得注意的是中医药院校出现的频次普遍较高,前10的机构中有一半为中医药大学或者中医药学院,这说明代谢组学在中医药领域有广泛的应用。
 
图1-2 研究机构被引聚焦图
Fig.1-2 The cited focus map of research institutions
表1-1  研究机构及引用频率表
Table 1-1 The table of research institutions and reference frequency 
机构名称 被引频次
山西大学中医药现代研究中心 20
山西大学化学化工学院 18
广东药学院中药学院 13
国家生物医学分析中心 13
中国药科大学药物代谢动力学重点实验室 10
南方医科大学中医药学院 10
中国科学院大连化学物理研究所 9
江西中医学院现代中药制剂教育部重点实验室 9
北京中医药大学基础医学院 8
新疆医科大学药学院 8
2.3 作者分析
    作者分析主要用于观察本研究主题范围内主要的研究人员及研究人员的关系。CiteSpace III软件提供了作者分析的功能,本实验分析作者之间的关系是将网络节点(Node Types)设置为作者(Author),时间间隔(Time slice)为2 years,算法选择Pathfinder,其余参数均为默认值。利用CiteSpace III软件进行作者合作网络分析(图1-3)。从作者合作网络图谱中可以看出,国内代谢组学应用于中药研究也拥有了一些相对稳定的科研合作群体,主要的研究团队有是国家生物医学中心颜贤忠、张琪为核心的研究团队,以及山西大学秦雪梅、李震宇研究团队,中国药科大学王广基、阿基业、刘林生为中心的合作团队、新疆医科大学的巴吐尔.买买提明、哈木拉提.吾甫尔研究团队、中国科学院大连化学物理研究所的许国旺研究团队以及江西中医学院现代中药制剂教育部重点实验室的刘红宁、徐国良、张启云研究团队等,这些研究团队都是国内代谢组学应用于医药研究领域的主力军,其中仅颜贤忠团队与王广基团队、杨永霞团队与龚梦娟团队有网络连接,说明各团队之间的交流合作较少。由各节点年轮的大小、颜色和厚度可知[24],秦雪梅则是后起之秀,被引频次第二,集中在2013年至2014年时间段。颜贤忠的被引频次最高,且集中在2009年至2010年时间段,自2005年后每个时间段都有被引记录,说明其研究成果优秀,在代谢组学研究中影响显著。许国旺、王广基、徐国良等团队被引频次较高,被引记录几乎覆盖所有时间段,说明其研究成果有较好的参考价值。
 
图1-3 研究人员的作者网络图  
Fig.1-3 The network map of authors
2.4研究热点
研究热点是某一时期内,有内在联系的、数量相对较多的一组文献共同探讨的科学问题或专题[25]。文献的关键词是对学术论文核心内容的浓缩和提炼,是对文章主题的高度概括,在文献分析中 频次较高的关键词上可以看作是该领域的研究热点[26-27]。 本文借助 CiteSpace III对文献中的关键词进行分析,通过高频关键词分析代谢组学在医药研究领域的研究热点。
    数据源导入CiteSpace III软件后,设置网络节点为关键词(Keyword),算法选择Pathfinder,其余均设置均为默认值,从CiteSpace III软件导出的热点词信息中选取热点词中频次排名较高的词,可以得到该领域的高频热点词统计表,分析出代谢组学在医药领域的研究热点,结果见表2。节点中心度是评价网络中节点在整体网络中所起连接作用大小的度量,中心度大的节点相对地容易成为网络中的关键节点。由表1-2可知,“代谢组学”,“模式识别”、“主成分分析”、“核磁共振”、“生物标志物”、“气相色谱”,这些关键词出现的频率较高同时这些词汇的在网络中中心度也较高,说明这些词汇是本研究主题的研究热点。其中模式识别和主成分分析是代谢组学研究的主要数据分析方法,核磁共振及气象色谱是代谢组学研究的主要仪器设备,而生物标记物或生物标志物的发现是代谢组学的主要目标。
表1-2  热点关键词的文献计量学参数表
Table 1-2 The bibliometric parameters table of hotspot keywords
序号 热点词 频次 中心度
1 代谢组学 390 0.42
2 核磁共振 77 0.34
3 模式识别 33 0.19
4 主成分分析 25 0.11
5 尿液 22 0.18
6 生物标志物 16 0.2
7 大鼠 14 0.2
8 气相色谱-质谱 14 0.24
9 生物标记物 14 0.12
10 肝毒性 11 0
11 四氯化碳 5 0.12
2.5研究前沿和趋势
一个学科领域的研究前沿和发展趋势主要由这个学科正在兴起的主题词来判断,CiteSpace III软件提供的突现词探测技术和算法,用于考察关键词的时间分布,探测变化频率高的关键词,从而确定前沿领域和发展趋势[28-29]。并绘制出共词可视化网络图谱的Time line图,准确清晰的展示2005年1月至2014年12月代谢组学的研究前沿,如图1-4。结果显示,从2005年至2014年,在医药研究领域出现与代谢组学相关的突现词最时间不断变化,出现最早的突现词是“模式识别”,“核磁共振”及“尿样”,这些关键词集中在 2005 年后的区域,这些关键词突现性和Sigma值较高,说明当时代谢组学早期阶段主要的技术方法是核磁和模式识别技术,主要的生物样本是尿样。这些突现词不仅反映了代谢组学技术的发展,同时也反映代谢组学技术在医药领域的应用的领域的不断变化,从突现词的时区分布图可以发现 2006以来,突现词对于医药领域的研究 经理了糖尿病,中医症候,高血压,乳腺癌,逍遥散的变化,说明代谢组学的在医药研究应用领域随时间不断变化,近年来的发展趋势显示代谢组学在复杂性疾病(如癌症、糖尿病、高血压)及中医中药领域具有广泛的应用,这也是近年来代谢组学的研究前沿和以后的发展趋势。 
 
图1-4  代谢组学突现词的可视化网络
Fig.1-4 The visualization network of metabolic markers
3结论
    本文以CNKI数据库中代谢组学为主题的相关文献为载体,通过CiteSpace III软件的数据处理和分析,用知识图谱的方式展示了代谢组学领域的研究机构分布以及相关的核心研究团队、热门关键词等,分析了代谢组学领域的前沿发展趋势,由分析结果得出以下结论:
①除个别年份外,代谢组学在医药研究领域的文献呈逐年增长趋势,相信在未来一段时间内代谢组学仍然会蓬勃发展,成为医药研究中的热点领域。②山西大学中医药现代研究中心、山西大学化学化工学院、广东药学院中药学院、国家生物医学分析中心、中国药科大学药物代谢动力学重点实验室等在代谢组学研究中占领先地位。③秦雪梅、颜贤忠、王广基、徐国良等科研团队是代谢组学的核心研究团队,为代谢组学研究作出了巨大贡献,但团队之间交流合作较少。④通过对关键词的统计分析发现代谢组学的研究热点为:代谢组学、核磁共振、模式识别、主成分分析、尿液、生物标志物等。⑤通过对突现词探测发现代谢组学的在医药领域的研究经历了主要技术方法完善,研究应用经历糖尿病、中医症候及中药复方研究等阶段,随着时间的变化代谢组学技术逐渐成熟,其主要技术包括核磁、质谱及模式识别的数据分析方法,代谢组学的研究重点由技术方法的完善转向在医药领域的应用,从突现词的时间变化趋势上看、代谢组学应用领域经历了复杂性疾病及中医证、中药方的研究中,在未来一段时间内对于复杂性疾病(糖尿病、癌症、高血压等)及中药复方(如逍遥散)的研究可能成为未来代谢组学在医药领域研究的研究趋势。
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
第二章 血浆代谢组学的UPLC-MS/MS分析方法研究
 
代谢组学是一门21世纪新兴学科,是继基因组学和蛋白质组学之后发展起来的一种研究生物系统的组学方法,通过分析生物体液及组织中的小分子物质,研究生物体系中内源性代谢物质种类、数量及其变化规律,并探索内在或外在因素对生物体中内源性代谢物质的影响规律和机理。[30,31]
代谢物组即代谢组学的研究对象,是相对分子质量在1000Da以下的生物小分子,其种类繁多,理化性质各异,含量低,动态范围广。为了达到准确无偏向的全面分析目的,代谢组学分析技术的选择非常重要。
常规反相液相色谱( RPLC) 在分离复杂生物样品时分离度较低、分析时间较长,而超高效液相色谱( UPLC ) 具有更高的分离能力和更高的峰容量[32],可以在高压系统下操作,实现快速有效分离。UPLC的高分辨能力使峰宽变窄、信噪比增强,从而提高了生物样品分析的选择性和效率。因此,与传统 RPLC 相比,UPLC 能获得更多代谢物的信息,对于复杂生物样品的分离具有显著优势[34],在生物学研究中也得到了广泛的应用。
目前,代谢物整体水平的检测分析技术主要采用以核磁共振谱(NMR)、质谱(MS)为核心的分析技术以及色谱与波谱联用技术(如NMR、LC-NMR或LC-NMR-MS、LC-MS和GC-MS等)。随着高效液相与质谱联用技术(UPLC-MS) [35,36,37]、气相色谱与质谱(GC-MS) [38,39]联用技术和高效液相与核磁共振联用技术(LC-NMR)的发展与成熟, LC-MS、GC-MS、LC-NMR联用技术己广泛应用于代谢组学的研究[40,41,42]。NMR技术具有无偏向性、无损伤样品等特点,但灵敏度低、检测动态范围窄;而MS及MS/MS技术具有高灵敏度和高专属性的特点,可以实现多个化合物的快速检测和定量分析。结合UPLC和GC的高分离能力,充分发挥质谱检测器灵敏度高,特异性强的特点, LC-MS、GC-MS在同分异构体鉴别方面也越来越受到大家的关注[35,43]。但相比GC-MS而言,LC-MS能分析高极性和分子量相对更高的化合物,更适合于代谢组学生物样本中复杂代谢产物的检测和潜在标志物的鉴定,故在代谢组学研究领域,LC-MS是一种极具优势的分析方法。
1 实验材料
1.1药品与试剂
对照品:次乌头碱 (批号:130509)、苯甲酰新乌头原碱(批号:130505),均购自四川省维克奇生物科技有限公司;甲醇及乙腈,质谱级,德国默克公司;甲酸,色谱纯,美国DikmaPure公司;超纯水为Milli-Q制备。
1.2仪器
 BT225-电子分析天平(德国Sartorius公司);KQ-300VDE型双频数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);高速冷冻离心机(德国Thermo Fisher公司);涡旋仪(IKA VORTEX  GENIUS 3);氮吹仪(上海比朗仪器有限公司干式氮吹仪 DN-24A);Milli-Q 超纯水仪(美国Millipore公司);岛津超高效液相色谱仪LC-30A与三重四级杆质谱仪ABQ-TRAP5500联用系统(数据采集 Analyst 1. 6. 1 ABsciex)。
1.3含药血浆制备
动物分为正常对照组、模型组、早期参附注射液剂量3.3ml/kg组、早期参附注射液剂量15ml/kg组、早期参附注射液剂量20ml/kg组、中期参附注射液剂量3.3ml/kg组、中期参附注射液剂量15ml/kg组、中期参附注射液剂量20ml/kg组。给药一小时后,股动脉取血置已加肝素钠抗凝EP管中,涡旋混匀1min,4500rpm/min离心10min,分离血浆,置于-80℃冰箱低温保存备用。
2测定条件
2.1 色谱条件
色谱柱为Waters ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱( 50 mm ×2. 1 mm,1. 7 μm);流动相: 0.1%甲酸-水(A)与乙腈(B),流速:0.4mL•min-1;柱温:40℃;进样量:1μL;梯度洗脱,0~2min,0.1%~0.1%B,2~6.4min,0.1%~22%B,6.4~9min,22%~35%B,9~22min,35%~100%B,22~23min,100%~100%B,23~24min,100%~90%B ,24~25min,90%~0.1%B 。
2.2质谱条件
采用电喷雾(ESI)源;Gurtain Gas(CUR) 30 kPa;Temperature(TEM)500℃,Collision Gas(CAD) 8 kPa,Ion Spray Vottage(IS)为5500 V;检测方式为正离子多反应监测模式( MRM),各成分与内标母离子→子离子对质荷比(m/z)、碎片能量及撞击能量,见表2-1。
表2-1  各被测成分及内标优化的MRM检测模式参数
Table2-1  Optimized MRM detection mode parameters of tested components and internal standard (IS)
成分 对质荷比(m/z) 碎片能量(eV) 撞击能量(eV)
次乌头碱 616.3→556.3 43 43
苯甲酰新乌
头原碱 590.3→482.2 70 50
3溶液配制
对照品母液:精密称取次乌头碱3.00mg、苯甲酰新乌头原碱3.00mg,用甲醇溶解于10 mL容量瓶中并定容,得到各对照品母液。
混合对照品储备液:取各对照品母液适量于5 mL容量瓶中,用甲醇定容得对照品储备液,分别含有次乌头碱150 ug•mL-1、苯甲酰新乌头原碱150ug•mL-1。
4血浆样品处理
精密移取100μL血浆样品,加入300 μL甲醇溶液及50μL混合内标溶液,涡旋1 min,静止3 h后,4℃、15000 RCF离心10 min,取上清液,30℃下氮气吹干,残留物加200μL甲醇-水溶液(15:85)溶解,涡旋1 min,4℃、15000 RCF离心15min,取上清液既得UPLC-MS/MS分析样品。
5方法学考察
5.1专属性考察
取空白血浆、混合对照品血浆及给药血浆样本各100μL,按4项下处理后,以2项下液相-质谱条件下,进行UPLC-MS/MS分析。
5.2线性关系考察
先将混合对照品储备液用甲醇稀释成不同浓度,取每个浓度对照品50μL加于100μL空白血浆中,制成混合标准对照品血浆样品,平行设置3份,按4项下的方法处理,进行UPLC-MS/MS测定,以次乌头碱成分对照品峰面积为纵坐标,次乌头碱成分浓度为橫坐标,求得次乌头碱成分回归方程;以苯甲酰新乌头原碱成分对照品峰面积为纵坐标,苯甲酰新乌头原碱成分浓度为橫坐标,求得苯甲酰新乌头原碱成分回归方程。
5.3 日内及日间精密度考察
大鼠空白血浆中分别加入高、中、低3个浓度的混合对照品,配制成高、中、低3个浓度的混合对照品的质控(QC)样本,每个浓度平行5个样本,按4项下的方法处理后,连续进样5 d。进行UPLC-MS/MS分析,以第1天 5个样本的被测成分高、中、低3个浓度的峰面积∕内标峰面积数值,通过定量软件计算各被测成分高、中、低3个浓度的日内精密度(RSD);以连续5天测定的被测成分高、中、低3个浓度的峰面积∕内标峰面积数值,通过定量软件计算各被测成分高、中、低3个浓度的日间精密度(RSD)。
5.4提取回收率和基质效应考察
按5.3项下制备高、中、低3个浓度混合对照品的QC样本,并按4项下的方法处理样品,取上清液进样UPLC-MS/MS分析,所得峰面积为A类;另取100 μL空白血浆,加入300 μL甲醇溶液,涡旋1 min,静止3 h后,4℃、15000 RCF离心10 min,取上清液,分别加入50μL高、中、低3个浓度的混合内标溶液,涡旋1 min ,30℃下氮气吹干,残留物加200 μL甲醇-水溶液(15:85)溶解,涡旋1 min,4℃、15000 RCF离心15min,取上清液进样UPLC-MS/MS分析,所得峰面积为B类;另取300μL甲醇,分别加入50μL高、中、低3个浓度的混合内标溶液,涡旋1 min,静止3 h后,4℃、15000 RCF离心10 min,取上清液,30℃下氮气吹干,残留物加200 μL甲醇-水溶液(15:85)溶解,涡旋1 min,4℃、15000 RCF离心15min,取上清液进样UPLC-MS/MS分析,所得峰面积为C类。以前两种方法下处理的各被测成分高、中、低3个浓度的峰面积的比值计算提取回收率,即A/B;并以在后两种方法下处理的各被测成分高、中、低3个浓度的峰面积的比值计算基质效应,即B/C。
5.5 稳定性考察
按5.3项下制备4批高、中、低3个浓度的混合对照品QC样本,每浓度5份,分别进行以下稳定性的考察。按4项下的样品方法直接处理后,分别考察(a)短期室温稳定性:25 ℃下放置12 h;(b)长期冻存稳定性:-20℃保存一个月;(c)反复冻融稳定性:-20℃冻存4 h后,25℃放置4 h,反复3次。各样品进行UPLC-MS/MS检测,用定量软件分析计算出各被测成分高、中、低3个浓度的相对标准偏差(RSD),分别描述各对照品在不同条件下保存的稳定性。
6含药血浆测定
含药血浆样品按照4项下的方法平行处理3份,按照2项下的测定条件,进行UPLC-MS/MS检测,测定含药血浆中次乌头碱和苯甲酰新乌头原碱有效成分的含量。
7 结果
7.1 专属性考察结果
按2项下UPLC-MS/MS条件,空白血浆样品、混合对照品血浆样品及给药后血浆样品图谱见图2-1。可见,采用正离子方式、多反应监测(MRM)模式,各被测成分专属性性强,灵敏度高,血浆中杂质不干扰样品中各被测成分含量测定。
 
 
 
图2-1 各被测成分多反应检测(MRM)模式质谱图谱
Figure.2-1  The MRM spectrum of components
(注:A:空白血浆样品;B:早期剂量3.3ml/kg组含药血浆样品;C:早期15ml/kg组含药血浆样品;D:早期剂量20ml/kg组含药血浆样品; .E中期剂量3.3ml/kg组含药血浆样品;F:中期剂量15ml/kg组含药血浆样品;G:中期剂量20ml/kg组含药血浆样品。1.苯甲酰新乌头原碱tR=8.5 min;2. 次乌头碱tR=10.5min。)
7.2各被测成分回归方程
见表2-2。相关系数r2在0.9900~0.9999之间,说明在各被测成分的线性回归范围内,线性关系良好。
表 2-2  各被测成分的线性方程和线性范围
Table 2-2  The linear equations and linear ranges of components
成分 线性范围(ng/ml) 线性回归方程
 
次乌头碱
0.04~3750
y = 3795.x - 44756
0.999
 
苯甲酰新乌头原碱
0.04~3750
y = 121.6x + 1747
0.999
 
7.3 精密度考察结果
各被测成分日内与日间的精密度RSD均小于15 %;说明在2项下UPLC-MS/MS条件下,各被测成分高、中、低3种浓度日内、日间精密度均良好,见表2-3。
表2-3 各被测成分在血浆基质中的精密度(n=5)
Table 2-3 The precision of the components to be measured in plasma
成分 理论值(ng/ml) 日内RSD% 日间RSD%
10.415 1.6546 14.6344 
次乌头碱 12500 1.2862 12.7503 
18750 0.7115 5.1384 
0.0415 8.0747 8.9503 
苯甲酰新乌头原碱 12500 2.3980 13.5013 
  18750 1.9227 13.6623 
 
7.4 提取回收率结果
各对照品物质高、中、低3种浓度的质控(QC)样本提取回收率都在75 %~100 %之间,满足生物样本提取回收率要求;且各成分基质效应基本符合不小于75 %或不大于120 %,基质没有影响生物样本中各成分的含量测定,见表2-4。
表2-4  各被测成分在血浆基质中的提取回收率(n=5)
Table 2-4  The extraction recovery of components to be measured in plasma
成分 浓度(ng/ml) 提取回收率(%) 基质效应(%)
10.415 95.15±0.12 90.63±0.10
次乌头碱 12500 79.82±0.04 98.16±0.05
18750 78.87±0.06 85.09±0.01
0.0415 99.34±0.13 90.84±0.07
苯甲酰新乌头原碱 12500 75.90±0.03 104.59±0.11
  18750 84.20±0.05 58.71±0.04
7.5稳定性考察结果
各被测成分高、中、低3种浓度质控(QC)样本血浆前处理稳定性、短期室温稳定性、长期冻存稳定性、反复冻融稳定性的RSD均±15 %范围内,说明次乌头碱和苯甲酰新乌头原碱成分高、中、低3种浓度的血浆样品稳定性良好,见表2-5。
表 2-5 各被测成分血浆样品不同条件下稳定性考察
Table 2-5 The stability of components in plasma samples under different conditions
成分 理论值(ng/ml) RSD%
短期室温稳定性 长期冻存稳定性 反复冻融稳定性
10.415 1.6546 1.6905 13.8858 
次乌头碱 12500 1.2862 1.5480 7.3125 
18750 0.7115 0.5993 5.1349 
0.0415 8.0747 9.7322 8.9444 
苯甲酰新乌头原碱 12500 2.3980 2.8888 6.3194 
  18750 1.9227 2.3520 8.2493 
7.6含药血浆样品测定结果
(见表2-6)
表2-6  含药血浆含量测定结果(ng•mL-1)
Table 2-6 The contents of components in plasma containing samples
成分 理论值 含药血浆样品含量
ng/ml 1 2 3 X±S
次乌头碱 早期-3.3ml/kg 11.95 11.94 11.95 11.95±0.01
早期-15ml/kg 11.86 11.85 11.85 11.85±0.00
早期-20ml/kg 11.87 11.88 11.88 11.88±0.01
中期-3.3ml/kg 11.85 11.85 11.85 11.85±0.00
中期-15ml/kg 11.84 11.86 11.85 11.85±0.01
中期-20ml/kg 11.86 11.90 11.88 11.88±0.02
苯甲酰新乌头原碱 早期-3.3ml/kg 0.45 0.34 0.82 0.54±0.25
早期-15ml/kg 1.64 1.04 2.40 1.69±0.68
早期-20ml/kg 8.58 5.12 6.56 5.66±1.73
中期-3.3ml/kg 0.53 0.26 0.16 0.32±0.19
中期-15ml/kg 1.59 0.85 1.72 1.1±0.47
中期-20ml/kg 5.70 4.88 5.23 5.27±0.41
8讨论
本实验建立了UPLC-MS/MS法同时检测血浆中参附注射液中次乌头碱和苯甲酰新乌头原碱含量的方法,各被测成分专属性强,无杂质干扰其含量准确测定;在各成分的线性范围内,回归方程线性良好(相关系数R2>0.99);各被测成分日内、日间精密度良好(RSD值均在±15%范围内);提取回收率和基质效应均满足生物样本分析测定的要求;各被测成分在样品处理前及各保存条件下稳定性良好。因此本方法各项方法学考察良好,能快速、准确、灵敏地同时测定次乌头碱和苯甲酰新乌头原碱在大鼠血浆中的含量,为该复方的含药血浆质量控制﹑药代动力学及血浆药理学的研究提供依据,也证明了该分析方法是准确可靠,为后期血浆代谢组学研究奠定了基础。
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
第三章参附注射液治疗心源性休克早期的血浆代谢组学研究
 
心源性休克早期心肌细胞处于缺血缺氧期,血压正常甚至轻度增高或稍降,心率加快,脉压差变小,微循环状态是少灌少流、灌少于流。心源性休克患者主要的死亡原因是心力衰竭,参附注射液能够显著改善心力衰竭急性发作期患者的心功能[44]。目前对参附注射液治疗心源性休克的作用机制研究较少,且未明确对心源性休克分期。中医讲究辨证论治,在疾病发生发展的过程中,其生理、病理状态也是不断变化的,疾病治疗应对“症”下药。
本文基于超高效液相色谱与串联四级杆飞行时间质谱仪( Ultra-performance liquid chromatography coupled with quadrupole time-of-flight mass spectrometry,UPLC / Q-TOF-MS) 联用技术,利用其快速分离和高灵敏度的特性,采集大鼠心源性休克早期血浆样品的代谢图谱信息。运用Progenesis QI进行数据预处理,结合 EZinfo 2.0 统计软件进行多变量统计分析,筛选出有显著性差异的生物标志物群,分析心源性休克早期模型对大鼠体内内源性物质的影响;并通过metPA网络软件(Metpa.metabolomics.ca/)分析生物标记物参与的代谢通路,探讨参附注射液治疗心源性休克早期的作用机制。
1 实验动物
健康SD雄性大鼠30只,体重(335±15)g,清洁级,由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供,许可证号:SCXK(湘)2013-0004。饲养环境的室温为22±2℃,相对湿度为50-60%RH。将其随机分为5组:正常组、早期模型组、剂量3.3ml/kg组,剂量15ml/kg组和剂量20ml/kg组。
2 血浆样本
结扎大鼠左冠状动脉近心尖端,建立大鼠心源性休克早期模型[45],造模成功后,静脉给药,于60min后股动脉取血,置于装有肝素钠的EP管中,离心取上清液,放于-80℃保存。
3 仪器与试剂
3.1 仪器
WatersAcquity UPLC 液相色谱系统、Q-TOF SYNAPT G2 HDMS 质谱仪和 Waters ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱( 50 mm ×2. 1 mm,1. 7 μm);高速冷冻离心机(德国Thermo Fisher公司);涡旋仪(IKA VORTEX  GENIUS 3);氮吹仪(上海比朗仪器有限公司干式氮吹仪 DN-24A)。
3.2 试剂
参附注射液(雅安三九药业有限公司,批号:140213010);色谱纯级别甲醇(德国 Merck 公 司);色谱纯级别乙腈(德国 Merck 公 司);色谱纯级别甲酸(美国DikmaPure公司);超纯水 (Milli-Q 超纯水系统,美国 Millipore 公司)。
4 样品制备
将冻存血浆室温解冻,取100ul血浆于1.5mlEP管,加甲醇300ul,涡旋混匀1min,4℃恒温静置3h,离心(4℃,15000RCF,10min)后取上清液于1.5mlEP管,30℃水浴氮气吹干,保存至-80℃。
复溶:加水-甲醇溶液(水:甲醇=85:15)200ul定容,涡旋混匀1min,离心(4℃,15000RCF,15min),取上清液于样品瓶,既得。
5采集条件及样品分析
正模式色谱条件: 水相A:超纯水(0.1%甲酸),有机相B:乙腈;梯度洗脱方法见表3-1。柱温40℃,样品室温度10℃,流速为0.4ml/min,进样量为1ul。
表3-1 液相条件
Table 3-1 Liquid phase conditions
Time Flow(ml/min) B% Curve
0 0.4 0.1
2 0.4 0.1 6
6.4 0.4 22 6
9 0.4 35 4
22 0.4 100 6
24 0.4 100 6
32 0.4 90 5
34 0.4 0.1 6
36 0.4 0.1 6
 
负模式色谱条件:水相A:超纯水(0.1%甲酸),有机相B:乙腈;梯度洗脱:0~20min,5%~95%B;20~23min,95%~5%B。柱温40℃;样品室温度10℃;流速为0.3ml/min;进样量为1ul。
质谱条件: 电离源温度100 ℃,锥孔气为氮气,流速 50 L/h;去溶剂气为氮气,温度400 ℃,流速800 L/h。正离子模式下毛细管电压为3.0 kV,锥孔电压为40 V,提取锥孔电压为 80 V,采集时间为0~25min,质量数范围为50~1000Da;负离子模式下毛细管电压为 2.5 kV,锥孔电压为 40 V,补偿电压为 80V。为确保质量的准确性和重复性,采用甲酸钠建立质量轴标准曲线,亮氨酸脑啡肽进行实时质量校正。串联质谱碰撞气为氩气,低碰撞能为 4 eV,高碰撞能为 20 ~40 eV。
为保证整个分析系统的稳定性,在本实验中使用质控样品( Quality control,QC) 进行方法验证,QC样品由每个正常样品各取 5μL 混合而得。为避免误差样品的检测顺序为随机进行。样品的检测过程中,每检测7个正常样品后运行1 次 QC 样品以衡量系统的稳定性。
6数据处理
通过MarkerLynx 检测样本信息,得到样品TIC图,利用ProgenesisQi对采集得到的谱图进行离子对的提取、峰对齐、峰匹配和峰强度校正等操作,将结果转化为包含化合物的保留时间和质荷比信息的 csv 格式文件。设计好实验分组,将处理后的数据矩阵导入EZinfo 2.0 统计软件进行多变量统计分析,进行有监督的偏最小二乘判别分析(PLS-DA)。根据样本的主成分得分作Score plot图,可判别组间差异并对组别进行分类,作散点图(Loading plot)可发现显著升高或降低的变量,选择投影变量(VIP)>1的变量作为生物标记物,此时得到其保留时间和质核比信息。使用 HMDB、KEGG等生物学数据库和metPA网络软件进行生物标志物的鉴定和代谢通路的分析。
7实验结果
7.1大鼠血浆代谢指纹图谱的建立
运用UPLC-Q-TOF MS进行血浆样品的分离和数据采集,得到各组大鼠的血浆代谢图谱。图3-1、图3-2分别是正、负离子模式下五组大鼠的总离子流图(TIC)。
 
图3-1 大鼠血浆样品的TIC总离子流图(ESI+)
Fig.3-1 TIC of rat plasma samples(ESI+)
 
图3-2 大鼠血浆样品的TIC总离子流图(ESI-)
Fig.3-2 TIC of rat plasma samples(ESI-)
(注:图中A代表空白组,B代表模型组,C代表剂量3.3ml/kg组,D代表剂量15ml/kg组,E代表剂量20ml/kg组。)
7.2心源性休克早期大鼠血浆代谢图谱的模式识别结果
7.2.1 ESI+模式下的PLS-DA分析
 
图3-3 正常组、模型组大鼠的PLS-DA分析得分图(ESI+)
Fig.3-3 The PLS-DA scores map of normalgroup and model group(ESI+)
 
(注:K代表正常组,M代表模型组)
7.2.2  ESI-模式下的PLS-DA分析
 
 
图3-4  正常组、模型组大鼠的PLS-DA分析得分图(ESI-)
Fig.3-4 The PLS-DA scores map of normalgroup and modelgroup(ESI-)
(注:NK代表正常组,NM代表模型组)
根据PLS-DA得分图(图3-3、图3-4)示:心源性休克早期大鼠与正常组大鼠,在正离子或者负离子模式下,皆可沿纵轴方向明显区分,说明两组间血浆小分子代谢物可区分,亦可再次验证心源性休克早期模型的成功建立[45]。
7.3参附注射液对心源性休克早期大鼠血浆代谢图谱的影响
7.3.1  ESI+模式下的PLS-DA分析
 
图3-5 正常组、模型组、给药组大鼠的OPLS-DA分析得分图(ESI+)
Fig.3-5 The PLS-DA scores map of normal group ,model group and dose groups(ESI+)
(注:K代表正常组,M代表模型组,4-代表剂量3.3ml/kg组,6-代表剂量15ml/kg组,7-代表剂量20ml/kg组。)
7.3.2  ESI-模式下的PLS-DA分析
 
图 3-6 正常组、模型组、给药组大鼠的OPLS-DA分析载荷图(ESI-)
Fig.3-5 The PLS-DA scores map of normal group ,model group and dose groups(ESI-)
(注:K代表正常组,M代表模型组,N4-代表剂量3.3ml/kg组,N6-代表剂量15ml/kg组,N7-代表剂量20ml/kg组。)
根据PLS-DA得分图(图3-5、图3-6)示:心源性休克早期3个给药组大鼠在正离子或者负离子模式下皆有往正常组变化的趋势,说明参附注射液对大鼠心源性休克中期治疗的血浆小分子代谢物有正向调节的作用。
8潜在生物标志物的筛选、鉴定及相关代谢通路分析
MSE技术是指在一次进样分析中同时获得高精确的母离子及碎片离子信息的串联质谱采集方法,并且可以对母-子离子的关联进行归属。MSE技术的特点在于能对所有的离子信息(母离子和碎片离子)都被记录,使定量、定性更加准确,且所有母离子与碎片离子信息都是高精度、高分辨的质谱数据。但MSE技术在使用时未能具体优化碰撞能能量,为获取更加准确、有价值的碎片信息,本实验对潜在生物标记物进行了MS/MS信息采集,优化其碰撞能量(CE),利用其准确有效的碎片信息与HMDB数据库匹配,鉴定生物标记物。
本研究中采用PLS-DA分析第一主成分VIP大于1的值,结合t检验的方法(p<0.05),并与HMDB内源性数据库匹配,筛选出具有差异性表达的内源性代谢物。再结合MSE的碎片信息与HMDB数据库匹配,初步筛选和鉴定出潜在生物标记物。本实验运用UPLC-Q-TOF/MS对潜在生物标记物进行了MS/MS信息采集,优化其碰撞能量(CE),利用其精确有效的碎片信息与HMDB、KEGG数据库匹配,鉴定潜在生物标记物。
根据鉴定结果显示,心源性休克早期模型使得1个病理型生物标记物发生了显著波动,但由于资源有限,未能鉴定出该病理性标记物。而在参附注射液治疗心源性休克早期过程中则找到4个具有显著差异的潜在生物标志物,通过已获得的MSE、MS/MS数据信息与HMDB数据库碎片信息匹配,最终鉴定出3个与参附注射液治疗心源性休克早期相关的生物标记物,分别为胸腺嘧啶核苷(Thymidine)、2-甲氧基-4-乙基苯酚(2-Methoxy-4-vinylphenol)和半胱氨酸谷胱甘肽二硫化物(Cysteineglutathione disulfide),其含量变化趋势见表3-2。采用metPA网络软件分析心源性休克早期模型的生物标记物参与的代谢通路,但并未找到相关代谢通路,有待进一步研究。
9讨论
胸腺嘧啶核苷和2-甲氧基-4-乙基苯酚的含量在低剂量组能达到正向调节的变化趋势,但高剂量则是反向调节的效果,推测可能调节作用达到饱和。半胱氨酸谷胱甘肽二硫化物的含量则三个给药剂量均能达到正向调节的变化趋势,且与参附注射液治疗心源性中期模型大鼠得到的半胱氨酸谷胱甘肽二硫化物生物标记物变化趋势一致。根据半胱氨酸谷胱甘肽二硫化物生物标记物在参附注射液治疗心源性中期模型大鼠过程可能参与的通路结果可知(见第四章),参附注射液治疗心源性早期模型大鼠过程中,半胱氨酸谷胱甘肽二硫化物可能与硫代谢有关联,也从侧面证明参附注射液对心源性休克早期有一定的治疗作用。 
表3-2参附注射液治疗心源性休克早期的生物标记物
Table 3-2 The markers of Shenfu injection in the treatment forearly cardiogenic shock
质荷比 保留时间 化学组成 英文名 代谢通路 趋势a 趋势b 趋势c 趋势d
281.0555 22.1592 C10H14N2O5 Thymidine 嘧啶代谢
301.1451 12.0315 C9H10O2 2-Methoxy-4-vinylphenol
427.0971 0.3628 C13H22N4O8S2 Cysteineglutathione disulfide   ↑** ↑***
 
(注:趋势a:与正常组比较,模型组的变化趋势;趋势b:与模型组比较,给药组3.3ml/kg的变化趋势;趋势c:与模型组比较,给药组15ml/kg的变化趋势;趋势d:与模型组比较,给药组20ml/kg的变化趋势。)
 
 
 
 
 
 
第四章参附注射液治疗心源性休克中期的血浆代谢组学研究
 
心源性休克中期心肌细胞处于淤血缺氧期,血压下降幅度明显,心率比早期时增快,脉压差比早期进一步变小,微循环状态是少灌少流、灌多余流。参附注射液对心力衰竭的患者有强心利尿回阳救逆固脱的功效[1],在临床上运用广泛。 代谢组学分析方法与中医药整体观相紊和,从整体的角度研究外界刺激对生物体内源性小分子的影响及变化规律,为中医证候和中药整体作用机制研究提供了新的研究思路和方法。
    本文基于UPLC/ Q-TOF-MS技术,利用其快速分离和高灵敏度的特性,采集大鼠心源性休克中期血浆样品的代谢图谱信息。运用Progenesis QI进行数据预处理,结合 EZinfo 2.0 统计软件进行多变量统计分析,筛选出有显著性差异的生物标志物群,分析心源性休克中期模型对大鼠体内内源性物质的影响;并通过Metpa网络软件(Metpa.metabolomics.ca/)分析生物标记物参与的代谢通路,探讨参附注射液治疗心源性休克中期的作用机制。
1 实验动物
健康SD雄性大鼠30只,体重(345±16)g,清洁级,由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供,许可证号:SCXK(湘)2013-0004.饲养环境室温22±2℃,相对湿度为50-60%RH,昼夜自然明暗交替照明,自由饮水。随机分为5组,正常组、早期模型组、剂量3.3ml/kg组,剂量15ml/kg组,剂量20ml/kg组。
2 血浆样本
结扎大鼠左冠状动脉远心尖端,建立大鼠心源性休克中期模型[45],造模成功后,静脉给药,于60min后股动脉取血,置于装有肝素钠的EP管中,离心取上清液,放于-80℃保存。
3 仪器与试剂
3.1 仪器
Waters Acquity UPLC 液相色谱系统、Q-TOF SYNAPT G2 HDMS 质谱仪和 Waters ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱( 50 mm ×2. 1 mm,1. 7 μm);高速冷冻离心机(德国Thermo Fisher公司);涡旋仪(IKA VORTEX  GENIUS 3);氮吹仪(上海比朗仪器有限公司干式氮吹仪 DN-24A)。
3.2 试剂
色谱纯级别甲醇( 德国 Merck 公 司);色谱纯级别乙腈( 德国 Merck 公 司);色谱纯级别甲酸(美国DikmaPure公司);超纯水 ( Milli-Q 超纯水系统, 美国 Millipore 公司)。
4 样品制备
将冻存血浆室温解冻,取100ul血浆于1.5mlEP管,加甲醇300ul,涡旋混匀1min,4℃恒温静置3h,离心(4℃,15000RCF,10min)后取上清液于1.5mlEP管,30℃水浴氮气吹干,保存至-80℃。复溶:加水-甲醇溶液(水:甲醇=85:15)200ul定容,涡旋混匀1min,离心(4℃,15000RCF,15min),取上清液于样品瓶,既得。
5采集条件及样品分析
正模式色谱条件:水相A:超纯水(0.1%甲酸),有机相B:乙腈;梯度洗脱方法见表4-1。柱温40℃,样品室温度10℃,流速为0.4ml/min,进样量为1ul。
表4-1 正模式液相条件
Table 4-1 The liquid phase condition of positive mode
Time(min) Flow(ml/min) B% Curve
0 0.4 0.1
2 0.4 0.1 6
6.4 0.4 22 6
9 0.4 35 4
22 0.4 100 6
24 0.4 100 6
32 0.4 90 5
34 0.4 0.1 6
36 0.4 0.1 6
负模式色谱条件:水相A:超纯水(0.1%甲酸),有机相B:乙腈;梯度洗脱方法见表4-2。柱温40℃,样品室温度10℃,流速为0.4ml/min,进样量为1ul。
表4-2负模式液相条件
Table 4-2 The liquid phase condition of negative mode
Time(min) Flow(ml/min) B% Curve
0 0.4 0.1
2 0.4 0.1 6
6 0.4 20 4
9 0.4 35 6
19 0.4 85 6
21 0.4 90 6
24 0.4 100 6
26 0.4 100 6
34 0.4 90 5
36 0.4 0.1 6
38 0.4 0.1 6
质谱条件: 电离源温度100 ℃,锥孔气为氮气,流速 50 L/h; 去溶剂气为氮气,温度400 ℃,流速800 L/h。正离子模式下毛细管电压为3.0 kV,锥孔电压为40 V,提取锥孔电压为 80 V,采集时间为0~25.5min,质量数范围为50~1000Da; 负离子模式下毛细管电压为 2.5 kV,锥孔电压为 40 V,补偿电压为 80V,采集时间为0 ~27min,质量数范围为50~1000Da。为确保质量的准确性和重复性,采用甲酸钠建立质量轴标准曲线,亮氨酸脑啡肽进行实时质量校正。串联质谱碰撞气为氩气,低碰撞能为 4 eV,高碰撞能为 20 ~40 eV。
    为保证整个分析系统的稳定性,在本实验中使用质控样品( Quality control,QC) 进行方法验证,QC样品由每个正常样品各取 5μL 混合而得。为避免误差样品的检测顺序为随机进行。样品的检测过程中,每检测7 个正常样品后运行1 次 QC 样品以衡量系统的稳定性。
6 数据处理
通过MarkerLynx 检测样本信息,得到样品的总离子流色谱图,利用Progenesis QI对采集得到的谱图进行离子对的提取、峰对齐、峰匹配和峰强度校正等操作,将结果转化为包含化合物的保留时间和质荷比信息的 csv 格式文件。设计好实验分组,将处理后的数据矩阵导入EZinfo 2.0 统计软件进行多变量统计分析,进行有监督的偏最小二乘判别分析(PLS-DA)。根据样本的主成分得分作Score plot图,可判别组间差异并对组别进行分类,作散点图可发现显著升高或降低的变量,选择投影变量VIP大于1的变量作为生物标记物,此时得到其保留时间和质核比信息。使用 HMDB、KEGG等生物学数据库和Met PA网络软件进行生物标志物的鉴定和代谢通路的分析。
7实验结果
7.1大鼠血浆代谢指纹图谱的建立
运用UPLC-Q-TOF MS进行血浆样品的分离和数据采集,得到各组大鼠的血浆代谢图谱。图4-1、图4-2分别是正、负离子模式下五组大鼠的总离子流图(TIC)。
 
图4-1 大鼠血浆样品的TIC总离子流图(ESI+)
Fig.4-1 TIC of rat plasma samples(ESI+)
(注:图中A代表空白组,B代表模型组,C代表剂量3.3ml/kg组,D代表剂量15ml/kg组,E代表剂量20ml/kg组。)
 
图4-2 大鼠血浆样品的TIC总离子流图(ESI-)
Fig.4-2 TIC of rat plasma samples(ESI-)
(注:图中A代表空白组,B代表模型组,C代表剂量3.3ml/kg组,D代表剂量15ml/kg组,E代表剂量20ml/kg组。)
7.2心源性休克中期大鼠血浆代谢图谱的模式识别结果
7.2.1  ESI+模式下的PLS-DA分析
 
图4-3 正常组、模型组大鼠的PLS-DA分析得分图(ESI+)
Fig.4-3 The PLS-DA scores map of normal group and model group(ESI+)
(注:K代表正常组,M代表模型组)
7.2.2  ESI-模式下的OPLS-DA分析
 
图4-4 正常组、模型组大鼠的PLS-DA分析得分图(ESI-)
Fig.4-4 The PLS-DA scores map of normal group and model group(ESI+)
(注:NK代表正常组,NM代表模型组)
    根据PLS-DA得分图(图4-3、图4-4)示:心源性休克中期大鼠与正常组大鼠,在正离子或者负离子模式下,皆可沿纵轴方向明显区分,说明两组间血浆小分子代谢物可区分,亦可再次验证心源性休克中期模型的成功建立[45]。
7.3参附注射液对心源性休克中期大鼠血浆代谢图谱的影响
7.3.1  ESI+模式下的PLS-DA分析
 
图4-5  正常组、模型组、给药组大鼠的PLS-DA分析得分图(ESI+)
Fig.4-5 The PLS-DA scores map of normal group ,model group and dose groups(ESI+)
(注:K代表正常组,M代表模型组,4-代表剂量3.3ml/kg组,6-代表剂量15ml/kg组,7-代表剂量20ml/kg组。)
7.3.2  ESI-模式下的PLS-DA分析
 
图 4-6 正常组、模型组、给药组大鼠的PLS-DA分析得分图(ESI-)
Fig.4-6 The PLS-DA scores map of normal group ,model group and dose groups(ESI-)
(注:K代表正常组,M代表模型组,N4-代表剂量3.3ml/kg组,N6-代表剂量15ml/kg组,N7-代表剂量20ml/kg组。)
根据PLS-DA得分图(图4-5、图4-6)示:心源性休克中期3个给药组大鼠在正离子或者负离子模式下皆有往正常组变化的趋势,说明参附注射液对大鼠心源性休克中期治疗的血浆小分子代谢物有正向调节的作用。
8潜在生物标志物的筛选、鉴定及相关代谢通路分析
本研究根据UPLC-Q-TOF/MS得到的各组样本信息,根据“2.5”中的数据处理方法,采用PLS-DA分析第一主成分VIP(Variable Importance for the projection,VIP)>1的值,结合t检验的方法(p<0.05)并与HMDB内源性数据库匹配,筛选出具有差异性表达的内源性代谢物。再结合MSE的碎片信息与HMDB数据库匹配,初步筛选和鉴定出潜在生物标记物。本实验运用UPLC-Q-TOF/MS对潜在生物标记物进行了MS/MS信息采集,优化其碰撞能量(CE),利用其精确有效的碎片信息与HMDB、KEGG数据库匹配,鉴定潜在生物标记物。
在HMDB、PubChem和KEGG中检索已鉴定的相关生物标记物,相应的ID号及基本情况注释见表4-3,采用metPA网络软件(Metpa.metabolomics.ca/)分析心源性休克中期模型的病理性标记物和参附注射液治疗心源性休克中期过程中的生物标记物参与的代谢通路,结果见表4-4。
表4-3 生物标记物信息
Table 4-3 Biomarkers information
Query Hit HMDB PubChem KEGG
HMDB00726 Isovalerylglutamic acid HMDB00726
133383
-
HMDB00672 Hexadecanedioic acid HMDB00672
10459
C19615
 
HMDB11170 L-gamma-glutamyl-L-isoleucine HMDB11170
14253342
-
HMDB00782 Octadecanedioic acid HMDB00782
70095
-
HMDB01282 Diadenosine hexaphosphate HMDB01282
123694
C20190
 
HMDB00814 N-Acetylglucosamine 6-sulfate HMDB00814
440235
C04132
 
HMDB06822 Formamidopyrimidine nucleoside triphosphate HMDB06822
440840
C05922
 
HMDB00061 Adenosine 3',5'-diphosphate HMDB00061
159296
C00054
 
HMDB00594 Glutamylphenylalanine HMDB00594
111299
-
HMDB00656 Cysteineglutathione disulfide HMDB00656
53477713
-
HMDB03337 Oxidized glutathione HMDB03337
975
C00127
 
HMDB03701 Dimethylbenzimidazole HMDB03701
675
C03114
 
HMDB01432 Agmatine HMDB01432
199
C00179
 
HMDB02320 Imidazolelactic acid HMDB02320
459122
C05132
 
表4-4 代谢通路汇总表
Table 4-4The summary table of metabolic pathways
Pathway Name Match Status p -log(p) Holm p FDR Impact
Sulfur metabolism
1/5
0.031732 3.4504 1 1 0
Folate biosynthesis
1/16
0.098413 2.3186 1 1 0.06957
Glutathione metabolism
1/26
0.15546 1.8614 1 1 0.03721
Arginine and proline metabolism
1/44
0.2501 1.3859 1 1 0.01561
Purine metabolism
1/68
0.36159 1.0172 1 1 0
根据筛选结果显示,心源性休克中期模型使得14个病理型生物标记物发生了显著波动,最终鉴定出3个病理性标记物(见表4-5-病理性标记物含量变化趋势表),分别为二腺苷六磷酸(Diadenosine hexaphosphate)、L-γ-γl-异亮氨酸(L-gamma-glutamyl-L-isoleucine)、二甲基苯并咪唑(Dimethylbenzimidazole)。与正常组比较,病理性标记物二腺苷六磷酸、L-γ-γl-异亮氨酸、二甲基苯并咪唑均表现为上升趋势;但代谢通路尚不明确。
参附注射液治疗心源性休克中期过程中共得到87个具有显著差异的潜在生物标志物,通过已获得的MSE、MS/MS数据信息与HMDB数据库碎片信息匹配,最终鉴定出14个与参附注射液治疗心源性休克中期相关的生物标记物,分别为二甲基苯并咪唑(Dimethylbenzimidazole)、胍丁胺(Agmatine)、异戊酰基谷氨酸(Isovalerylglutamic acid)、L-γ-γl-异亮氨酸(L-gamma-glutamyl-L-isoleucine)、谷酰基苯丙氨酸(Glutamylphenylalanine)、十六烷二酸(Hexadecanedioic acid)、十八烷二酸(Octadecanedioic acid)、咪唑乳酸(Imidazolelactic acid)、甲酰胺基嘧啶核苷三磷酸(Formamidopyrimidine nucleoside triphosphate)、二腺苷六磷酸(Diadenosine hexaphosphate)、腺苷3',5'-二磷酸盐(Adenosine 3',5'-diphosphate)、N-乙酰氨基葡萄糖-6-硫酸盐(N-Acetylglucosamine 6-sulfate)、半胱氨酸谷胱甘肽二硫化物(Cysteineglutathione disulfide)和氧化谷胱甘肽(Oxidized glutathione)。其中二甲基苯并咪唑、胍丁胺、异戊酰基谷氨酸、L-γ-γl-异亮氨酸、咪唑乳酸、二腺苷六磷酸、腺苷3',5'-二磷酸盐和N-乙酰氨基葡萄糖-6-硫酸盐的含量变化在低剂量给药组中呈反向调节,而在中、高剂量呈正向调节;半胱氨酸谷胱甘肽二硫化物和氧化谷胱甘肽的含量变化在三个给药组中均表现为正向调节;甲酰胺基嘧啶核苷三磷酸的含量变化只在高剂量组中呈正向调节;十六烷二酸的含量变化在低、中剂量中呈正向调节,但高剂量呈反向调节;谷酰基苯丙氨酸的含量变化只有在中剂量呈正向调节;十八烷二酸的含量变化在所有剂量组中均呈反向调节。这些生物标记物涉及硫代 
谢、谷胱甘肽代谢、精氨酸和脯胺酸代谢、嘌呤代谢和叶酸合成等途径,生物标记物含量的变化趋势及参与代谢途径见表4-6生物标记物含量变化趋势表和图4-7~图4-11。
 
表4-5 心源性休克中期模型的病理性生物标记物
Table 4-5 Pathological biomarkers of the mid - term model of cardiogenic shock
质荷比 保留时间 化学组成 英文名 代谢通路 趋势a
147.0927 0.7835 C9H10N2 Dimethylbenzimidazole -
241.1169 3.9643 C11H20N2O5 L-gamma-glutamyl-L-isoleucine - ↑*
994.9766 22.6076 C20H30N10O25P6 Diadenosine hexaphosphate - ↑*
注:“a”代表与正常组比较,模型组的变化趋势
 
 
 
 
 
 
 
 
 
表4-6 参附注射液治疗心源性休克中期的生物标记物
Table 4-6The biomarkersofShenfu Injection in the treatment for the mid - cardiogenic shock
质荷比 保留时间 分子式 英文名 代谢通路 趋势a 趋势b 趋势c 趋势d
147.0927 0.7835 C9H10N2 Dimethylbenzimidazole - ↓*
157.0615 15.5621 C6H8N2O3 Imidazolelactic acid -
212.0917 3.9214 C10H17NO5 Isovalerylglutamic acid -
241.1169 3.9643 C11H20N2O5 L-gamma-glutamyl-L-isoleucine - ↑*
300.0371 0.3486 C8H15NO9S N-Acetylglucosamine 6-sulfate -
408.0126 0.3700 C10H15N5O10P2 Adenosine 3',5'-diphosphate 硫代谢;
嘌呤代谢
169.0837 0.5128 C5H14N4 Agmatine 精氨酸和脯胺酸代谢
994.9766 22.6076 C20H30N10O25P6 Diadenosine hexaphosphate -  ↑*
425.0787 0.3629 C13H22N4O8S2 Cysteineglutathione disulfide - ↑*
611.1443 1.0399 C20H32N6O12S2 Oxidized glutathione 谷胱甘肽代谢 ↑*
521.9897 14.4979 C10H18N5O15P3 Formamidopyrimidine nucleoside triphosphate 叶酸合成
285.2045 12.5440 C16H30O4 Hexadecanedioic acid                                                                   -
293.1122 3.5365 C14H18N2O5 Glutamylphenylalanine -
313.2359 14.1266 C18H34O4 Octadecanedioic acid -
 
注:趋势a:与正常组比较,模型组含量的变化趋势
趋势b:与模型组比较,给药组3.3ml/kg含量的变化趋势
趋势c:与模型组比较,给药组15ml/kg含量的变化趋势
趋势d:与模型组比较,给药组20ml/kg含量的变化趋势
 
 
 
图4-7  精氨酸和脯胺酸代谢通路
Fig.4-7 Arginine and proline metabolism
(注;C00179代表胍丁胺(Agmatine),C00062代表L-精氨酸(L-Arginine),C00134 代表腐胺(Putrescine),C00533代表NO。)
 
 
图4-8谷胱甘肽代谢
Fig.4-8 Glutathione metabolism
(注:C00051代表谷胱甘肽, C00127代表氧化谷胱甘肽。)
 
图4-9 硫代谢
Fig.4-9 Sulfur metabolism
(注:C00054代表腺苷3',5'-二磷酸盐,C00094代表亚硫酸,C00053代表3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸,C00224代表腺苷硫酸,C00283代表硫化氢。)
 
图4-10嘌呤代谢
Fig.4-10 Purine metabolism
(注:C00054代表腺苷3',5'-二磷酸盐(Adenosine 3',5'-diphosphate),C0008代表ADP。)
 
图4-11叶酸合成
Fig.4-11 Folate biosynthesis
(注:C05922代表甲酰胺基嘧啶核苷三磷酸,C00044代表GTP,C00272代表四氢生物喋呤,C00504代表叶酸。)
9讨论
胍丁胺(Agmatine)、二甲基苯并咪唑(Dimethylbenzimidazole)、咪唑乳酸(Imidazolelactic acid)、异戊酰基谷氨酸(Isovalerylglutamic acid)、L-γ-γl-异亮氨酸(L-gamma-glutamyl-L-isoleucine)、N-乙酰氨基葡萄糖-6-硫酸盐(N-Acetylglucosamine 6-sulfate)、腺苷3',5'-二磷酸盐(Adenosine 3',5'-diphosphate)、甲酰胺基嘧啶核苷三磷酸(Formamidopyrimidine nucleoside triphosphate)、二腺苷六磷酸(Diadenosine hexaphosphate)都是高剂量才表现出与病理情况表现相反的调节作用,低剂量不能达到正向调节的作用,对参附注射液的剂量敏感。而半胱氨酸谷胱甘肽二硫化物(Cysteineglutathione disulfide)、氧化谷胱甘肽(Oxidized glutathione)则是三个给药剂量都能表现正向调节的作用,呈剂量依赖性。甲酰胺基嘧啶核苷三磷酸(Formamidopyrimidine nucleoside triphosphate)在本实验中只有当剂量达到20ml/kg时才表现正向调节作用。
在精氨酸和脯胺酸代谢通路中,胍丁胺的代谢产物是腐胺(Putreseine,Put,l,4一J二胺),见图4-7。腐胺与精眯(Spermidine,Spd,亚精胺,1,3,7一庚三胺)、精胺(Spermine,Spm,精素,l,3,7,10一癸四胺)共成为多胺,多胺广泛存在于生物细胞中,通常在哺乳动物体中含量甚微。L-精氨酸(L-Argine,L-Arg)为多胺及一氧化氮(NO)的共同前体, L-精氨酸一方面可在一氧化氮合酶(NOS)作用下生成NO,另一方面也可在精氨酸酶(Aginase)及鸟氨酸脱羧酶ODC作用下生成腐胺,腐胺再依次生成精脒、精胺,两种酶之间存在竞争性抑制[46]。
实验研究不断表明,内源性多胺有着非常重要的生物学功能,不仅与肿瘤的发生有关而且与机体的炎症反应紧密联系。多胺作为细胞因子参与炎症反应调节、促进损伤组织修复过程的性质,已引起各界的高度重视。腐胺与生物大分子合成、酶活性的调节、碳水化合物的代谢及能量供给有密切关系,并具有糖皮质激素样作用,是一个内源性的强效抗炎剂[47]。而在心衰患者中,全身的NO产量升高水平与心力衰竭的程度成正相关,NOS亚型的增量调节和增高的NO产量是神经元介质的激活和致炎(炎症前)细胞因子表达的结果之一,都是心力衰竭的本质特征[48]。原则上推测心源性休克模型组中心肌细胞受损伤,NO含量应比正常组高,竞争性地引起胍丁胺合成减少,含量降低;但实验结果表明模型组中胍丁胺含量呈增高趋势,故推测引起这种现象的原因可能是NO产量升高代偿性引起内源性NOS抑制物水平增高,即胍丁胺含量升高。在给予参附注射液治疗后,胍丁胺含量水平又得到了正向调节。
在谷胱甘肽代谢通路中,氧化谷胱甘肽(Oxidized glutathione)是谷胱甘肽(GSH)的氧化产物,见图4-8。谷胱甘肽在保护心肌细胞免受损伤方面可以发挥重要的作用[49],有研究显示,心血管疾病进程中氧化应激损伤是一个很重要的机制,而抗氧化剂对此有抑制作用。[50]谷胱甘肽是真核细胞内的主要还原剂, 与体内的其他抗氧化性物质一起构成了生物体内小分子抗氧化体系,清除自由基对膜类脂质、蛋白质的损伤。同时细胞内氧自由基(ROS)的清除通常伴随着谷胱甘肽的减少。心源性休克中期大鼠在给予参附注射液治疗后,氧化谷胱甘肽含量上升,根据其代谢相关途径,可推测为为谷胱甘肽还原剂在清除氧自由基的同时代谢为氧化谷胱甘肽(Oxidized glutathione),故给药组大鼠体内氧化谷胱甘肽含量较模型组呈上升趋势。
硫化氢(H2S )是重要的内源性心脏保护剂,有研究表明异丙肾上腺素心肌损伤大鼠中内源性 H2S 生成减少时,补充 H2S 可降低大鼠死亡率,提高心功能,保护心脏结构[51]。半胱氨酸可以与H2S互相转换,而H2S 在硫代谢通路中也是合成腺苷3',5'-二磷酸盐的底物。硫化氢可合成亚硫酸盐,亚硫酸盐经氧化成硫酸盐后代谢成腺苷硫酸(Adenylyl sulfate),最终代谢成腺苷3',5'-二磷酸盐,见图4-9。半胱氨酸在体内可加速同型半胱氨酸( Hcy) 自身氧化,产生过量氧自由基,导致氧化应激损伤。当内源性半胱氨酸生成过多时,可显著增加半胱氨酸双氧化酶( cysteine dioxygenase,CDO) 的转录和表达,增强半胱氨酸的氧化代谢,反馈性下调体内半胱氨酸水平,而半胱氨酸是合成半胱氨酸谷胱甘肽二硫化物的原料之一,故在心源性休克疾病状态时,半胱氨酸谷胱甘肽二硫化物含量较正常组偏低;也因此使更多的H2S代谢为腺苷硫酸盐、腺苷3',5'-二磷酸盐,腺苷3',5'-二磷酸盐在模型组中的量高于正常组。在给予参附注射液治疗后,机体半胱氨酸代谢向正常水平上调,故半胱氨酸谷胱甘肽二硫化物含量在给药组中呈升高趋势;同时,腺苷3',5'-二磷酸盐的合成减少,在给药组中呈下降趋势。
目前已证实, 心力衰竭时组织 ATP含量下降、伴有 ADP、AMP含量增加, 从而使心肌细胞利用 ATP 进行收缩的动力学受损, 加速了泵衰竭的进展[ 52,53]。腺苷硫酸盐在嘌呤代谢通路中可转化成ADP,在硫代谢通路中最终代谢为腺苷3',5'-二磷酸盐(见图4-10),而本实验结果显示在心源性休克疾病状态下,腺苷3',5'-二磷酸盐含量由于H2S代谢为腺苷硫酸盐的途径上调而升高,故ADP含量也应随之增加,这也与周远大等人的研究结果遥相呼应。在给予参附注射液治疗后,腺苷3',5'-二磷酸盐含量则受到正向调节的作用,在高剂量组中较模型组呈下降趋势。
在叶酸合成通路中,甲酰胺基嘧啶核苷三磷酸由GTP代谢而来,甲酰胺基嘧啶核苷三磷酸可合成四氢生物喋呤(Tetrahydrobiopterin,BH4), 见图4-11。同时,甲酰胺基嘧啶核苷三磷酸也是合成叶酸的中间产物。BH4是NOS的关键辅酶因子,在BH4充足时,NOS催化底物L-精氨酸生成一氧化氮(nitrogen monoxidum,NO),由于NO具有扩血管、防止血小板聚集等作用,而BH4对体内NO的水平有直接的影响,因此也与心血管系统的活动关系密切。心源性休克中期模型组中心肌细胞受损伤,NO含量应比正常组高[54],反向推测在心源性休克中期模型组中甲酰胺基嘧啶核苷三磷酸的含量也是较正常组升高的,在给予参附注射液治疗后, 高剂量组中甲酰胺基嘧啶核苷三磷酸的含量较模型组呈下降趋势,推测原因可能是甲酰胺基嘧啶核苷三磷酸一方面需要合成BH4,另一方面合成叶酸过程上调,有助于提高慢性心力衰竭的治疗效果[55,56,57]。
异戊酰基谷氨酸、L-γ-γl-异亮氨酸、谷酰基苯丙氨酸、十六烷二酸、十八烷二酸、咪唑乳酸、二腺苷六磷酸和N-乙酰氨基葡萄糖-6-硫酸盐等生物标记物虽在本实验中未明确找到其参与的代谢通路,但根据报道发现葡萄糖、果糖等代谢物有差异性改变,糖代谢紊乱可能是心肌缺血发病的危险因素之一[58],且急性心肌梗死血瘀证病理过程涉及氨基酸合成、转运及三羧酸循环[59],故在此推测这些生物标记物或许也参与其中,这也可预防和治疗心源性休克提供新的研究思路。
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
全文总结
 
本实验旨在探讨参附注射治疗心源性休克早、中期过程中对大鼠体内内源性成分的影响,从而进一步加深对其作用机制的探究。
我们应用文献计量学软件 CiteSpace III 分析了代谢组学在医药研究领域的文献计量学特征,发现在未来一段时间内对于复杂性疾病(糖尿病、癌症、高血压等)及中药复方(如逍遥散)的研究可能成为未来代谢组学在医药领域研究的研究趋势。
建立了UPLC-MS/MS法同时检测血浆中参附注射液中次乌头碱和苯甲酰新乌头原碱含量的方法,各项方法学考察良好,为该复方的含药血浆质量控制及血浆药理学的研究提供依据,也证明了该分析方法是准确可靠,为后期血浆代谢组学研究奠定了基础。
    在参附注射液治疗大鼠心源性休克早、中期的过程中发现胍丁胺、氧化谷胱甘肽、腺苷3',5'-二磷酸盐、甲酰胺基嘧啶核苷三磷酸等内源性成分发生了显著波动,这些生物标记物参与了大鼠体内的硫代谢、谷胱甘肽代谢、精氨酸和脯胺酸代谢、嘌呤代谢和叶酸合成等途径。根据生物标记物的生物学功能,推测参附注射液通过增强H2S和NO的表达降低大鼠死亡率,提高心功能,保护心脏结构,并且使大鼠体内自由基清除功能上升,以减少氧化应激损伤,从而达到治疗目的。
 
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