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小胶质细胞表型转化在缺血性脑白质损伤中的作用研究

来源:论文帮手 作者: 发布日期:2017-12-09 11:42:24

 

研究目的:以临床常见的缺血性脑白质损伤为研究切入点,研究S1P受体激动剂FTY720在小鼠低灌注脑白质损伤后对髓鞘脱失、认知功能障碍的影响,并探讨FTY720对低灌注后小胶质细胞活化、表型转化及少突胶质细胞存活、增殖、分化的影响;研究FTY720对原代培养的小胶质细胞表型的影响及干预后的小胶质细胞对少突胶质前体细胞分化成熟的影响。
研究方法:建立双侧颈总动脉狭窄(bilateral common carotid artery stenosis,BCAS)小鼠模型,采用 8 臂迷宫行为学测试方法,检测FTY720对小鼠造模后认知功能的影响;LFB染色观察FTY720对小鼠造模后髓鞘的影响;共聚焦显微镜观察FTY720干预后少突胶质细胞、小胶质细胞和髓鞘、轴突等在小鼠低灌注损伤后第 3 天、10 天、1 个月的动态变化;免疫磁珠细胞分选流式检测法检测小鼠低灌注后不同时间点FTY720对小胶质细胞表型的影响;体外培养原代小胶质细胞及少突胶质前体细胞(OPCs),采用RT-PCR、Wesrern blot法检测FTY720干预后小胶质细胞M1及M2型指标的变化;ELISA法检测小胶质细胞上清TNF-α、TGF-β、IL-1β、IL-13分泌量的变化;将干预后的小胶质细胞上清液加入纯化后的少突胶质前体细胞中,采用Olig2与MBP共染免疫荧光染色方法观察FTY720对少突胶质前体细胞分化成熟的影响。
研究结果:成功建立小鼠低灌注白质损伤模型(BCAS)。FTY720干预后,LFB评分显示白质区域损伤情况明显好于BCAS手术组。FTY720在低灌注后抑制小胶质细胞活化,促进小胶质细胞表型向M2型转化,促进少突胶质细胞的存活、增殖及分化,减轻小鼠的认知功能损害。FTY720处理可抑制LPS+IFNγ诱导的小胶质细胞M1型转化,增加M2型标记物的表达量;FTY720促进小胶质细胞向M2型转化。FTY720干预后的小胶质细胞促进少突胶质前体细胞的分化成熟。
结论:FTY720通过促进小胶质细胞向M2型转化,从而促进少突胶质细胞的存活、增殖、分化,减少髓鞘脱失,改善缺血性脑白质损伤,减轻小鼠的认知功能损害。因此FTY720有望成为缺血性脑白质损伤治疗的潜在靶点。
关键词:FTY720;低灌注脑白质损伤;小胶质细胞表型转化;少突胶质细胞
The effect of FTY720-mediated microglia polarization in ischemic white matter injury 
 Abstract
Objective:To investigate the effect of S1P receptor agonist FTY720 on myelination and cognitive dysfunction in mice in the mouse cerebral hypoperfusion model,and the effect of FTY720 on microglia activation,microglia polarization,oligodendrocyte survival,oligodendrocyte proliferation and oligodendrocyte differentiation. Methods:The bilateral common carotid artery stenosis (BCAS) model was established.8-arm maize test was used to examine reference memory faults and the working memory loss, both of which are designed for the effect of FTY720 on cognitive function.LFB staining was used to observe the integrity of myelin sheath structure in BCAS mice.Immunofluorescence staining was used to  observe the effect of FTY720 on oligodendrocytes , microglia ,myelin,and axon in BCAS mice at different time points (3rd, 10th day, and 1st month).Isolated microglia from neural cell suspensions using magnetic beads conjugated to CD11b monoclonal antibody to obtain the entire myeloid population. Polarization states of CD11b+microglia were evaluated by expression of M1 surface marker CD16/32、CD86 and M2 surface marker CD206、CD23. RT-PCR and Western blot were used to examine the polarization of microglia in vitro.ELISA was used to detect the supernatant of microglial cells in order to measure the levels of TNF-α, TGF-β, IL-1βand IL-13 . The supernatant of microglial cells was added to the purified oligodendrocyte precursor cells,then the differentiation of oligodendrocyte precursor cells were detected by immunofluorescence staining.
Results:BCAS mice model was successfully established.LFB staining verified that FTY720 can reduce the damage in white matter from BCAS. FTY720 inhibits the activation of microglia,promotes the microglia toward M2 polarization,promotes survival and proliferation and differentiation of oligodendrocyte,reduces the cognitive impairment in white matter from BCAS.FTY720 promotes the microglia toward M2 polarization and promotes oligodendrocyte differentiation in vitro.
Conclusion:FTY720 modulates microglia toward M2 polarization in the mouse cerebral hypoperfusion model and promotes the survival, proliferation and differentiation of oligodendrocytes, reduces myelination, improves ischemic white matter damage, and reduces the cognition impairment.Thus FTY720 may serve as a potential therapeutic target in the ischemic white matter damage.
Key words:FTY720;hypo-infusion induced white matter damage; micrroglia polarization;oligodendrocyte.
 
 
 
前言
    脑血管疾病,是世界上第三大死亡原因,是残疾的主要原因[1],具备复发率高,致残率高和死亡率高的“三高特征”。脑血管疾病分为出血性和缺血性脑血管疾病,缺血性疾病占脑血管疾病的60%-80%,众所周知的是缺血性脑血管疾病会导致灰质损伤,但是最近的研究发现慢性脑缺血主要引起脑白质损害[2],然而相对灰质损伤而言,对白质损害的研究在很大程度上被忽视,所以我们迫切需要治疗白质损害的方法。
脑白质区的血管解剖学结构是导致缺血性脑血管病易损伤此位置的主要原因。脑白质位于大脑深部,主要由长深穿支动脉供血,缺少侧支循环,尤其是脑室周围的白质是终末分水岭区,在缺血性脑损伤时更容易受损伤[3]。缺血性脑白质损伤是一个复杂的病理生理过程,主要病理生理表现为氧化应激、谷氨酸过度释放、激活ATP受体、神经炎性反应、小胶质细胞及星形细胞活化、少突胶质细胞减少、轴突变性、髓鞘脱失等[4-5]。而大量研究发现,缺血性脑白质损伤以胶质细胞增生及髓鞘不同程度脱失为基本特点[6-8]。此外,脑白质区含有丰富的炎性细胞,主要是胶质细胞,缺血性卒中后脑白质区的小胶质细胞大量被激活,而先前Kwon KJ等人的研究表明在动物低灌注脑白质损伤模型中神经炎性被认为是一种重要的病理过程[9],所以抑制炎性胶质细胞的活化能够保护缺血性脑白质损伤。
芬戈莫德(FTY720),是口服的免疫抑制剂,美国食品和药物管理局(FDA)2010年9月准许此药作为治疗多发性硬化的一线药物[10]。FTY720是鞘氨醇类似物,作用于S1P受体,FTY720的磷酸化形式是四种S1P受体(S1P1,S1P3,S1P4和S1P5)的高亲和力激动剂。在多发性硬化动物模型中FTY720被证明通过促进少突胶质细胞生长、成熟及髓鞘再生而治疗多发性硬化[11]。另外,最近研究表明病人口服FTY720可以治疗出血性脑血管病和缺血性脑血管病,如Ying Fu等人的研究表明轻到中度脑出血病人在72小时内口服FTY720可以减弱疾病进展、促进恢复[12];Fu-Dong Shi等人的研究表明急性缺血性卒中病人在72小时内口服FTY720抑制组织的第二次损伤、减缓疾病的进展、促进恢复[13]。而FTY720治疗脑血管疾病的主要机制是其抗炎作用[12-13]。因此,我们猜想FTY720可能对低灌注引起的缺血性脑白质损伤有保护作用且这种作用机制可能与抑制神经炎性有关。
   本研究通过建立小鼠低灌注脑白质损伤模型,研究FTY720对低灌注脑白质损伤的保护作用。采用免疫荧光、免疫印迹及免疫磁珠细胞分选流式检测等技术检测FTY720对中枢神经系统的炎性细胞-小胶质细胞表型转化的影响。与此同时体外培养原代小胶质细胞及少突胶质前体细胞(OPCs),研究FTY720对小胶质细胞表型的影响,为临床缺血性脑白质损伤疾病的治疗提供新的思路和潜在治疗靶点。
 
材料与方法
1. 实验动物
SPF级成年C57BL/6J雄性小鼠,体重(24-29)g,由华中科技大学附属同济医院动物实验中心提供。随机分组:假手术组(分离双侧颈总动脉后就缝合颈部切口,不上弹簧圈),BCAS 模型术后3天组20只,BCAS 模型术后10 天组20只,BCAS 模型术后1个月组20只,FTY720干预3天,10天,1月BCAS组各20只。动物饲养环境为清洁级,动物饲养于温度(22 ± 2)℃,湿度 50%~60%的动物房内,保持12 小时光/暗周期,自由获取水,喂食全价颗粒饲料。
SPF级1-3天的C57乳鼠,由华中科技大学同济医学院动物实验中心提供。
2.主要仪器
-80℃深低温冰箱 美国 Thermo 公司
荧光显微镜 日本 Olympus IX81
激光共聚焦荧光显微镜 日本 Olympus LSM1200 型 
台式低温离心机 德国 Eppendorf 5804R
低温高速离心机 德国 Eppendorf 公司
Microcoil 日本萨密你弹簧有限公司
电子天平 德国 Sartorius 公司
手术显微镜 德国 Zeiss 1-FR 型
水平摇床 德国 Schotte 公司
八臂迷宫及行为学摄像系统 上海欣软信息科技有限公司
恒温冰冻切片机 德国 Leica CM1900
移液器 美国 Eppendorf 公司
涡旋振荡器 德国 Ika 公司
高压蒸汽灭菌器 日本 Sanyo MLS-4750
Milli-Q 超纯水系统 美国 Millipore 公司
超声振荡器 美国Forma Scientific公司
恒温水浴锅 苏州净化设备有限公司 ZSBB-724
180ºC高温干烤箱 苏州净化设备有限公司 ZRD-5110
制冰机 日本 Sanyo公司
ECL曝光盒 美国Kodak公司
凝胶成像分析系统 美国Gene Genius公司
压膜机 上海永春仪器设备有限公司 PFS-200
低温冰箱 日本Sanyo公司
Bio-Rad•mini-protein蛋白电泳系统 美国Bio-Rid公司
37ºC 恒温摇床 苏州净化设备有限公司THZ-82
超净工作台 苏州净化设备有限公司ZHIH-C12148
CO2恒温培养箱 美国FormaScientific公司
一次性滤菌器 美国Minnipore公司
PCR基因扩增仪 瑞士Roche公司
 
3.主要试剂
异氟烷 同济医院药房
异丙嗪 同济医院药房
氯胺酮 同济医院药房
异戊烷 武汉谷歌科技有限公司
75%和 95%酒精 同济医院药房
多聚赖氨酸 北京中杉金桥生物公司
TritonX-100 武汉博士德生物工程有限公司
牛血清白蛋白 BSA 美国 Sigma 公司
正常羊血清 武汉博士德生物工程有限公司
甘油 美国 Sigma 公司
RIPA强裂解液 上海碧云天生物技术研究所
蛋白酶抑制剂 瑞士Roche公司
BCA蛋白定量试剂盒 武汉博士德生物工程有限公司
ECL曝光试剂盒 美国Thermo公司
脱脂奶粉 美国BD公司
多聚甲醛 国产分析纯试剂
DAPI 美国 Sigma 公司
固蓝(LFB)染液 武汉谷歌科技有限公司
二甲苯 武汉谷歌科技有限公司
兔抗 Iba-1 单克隆抗体 日本 wako 公司
小鼠抗 CC1 单克隆抗体 美国 Abcam 公司
大鼠抗Brdu单克隆抗体 美国 Abcam 公司
兔抗小鼠Olig2多克隆抗体 美国 Millipore 公司
大鼠抗小鼠CD68多克隆抗体 美国BD公司
Brdu 美国 Sigma 公司
FTY720 美国Cayman生物公司
山羊抗 MAG 单克隆抗体 美国 Santa Cruz 公司
大鼠抗 MBP 单克隆抗体 美国 Millipore 公司
小鼠抗 NF单克隆抗体 美国 Cell Signaling 公司
羊抗小鼠CD206多克隆抗体 美国R&D system公司
兔抗小鼠CD16/32多克隆抗体 美国BD公司
PE标记的抗小鼠CD11b单克隆抗体 美国BD公司
PerCP-Cy5.5标记的抗小鼠CD16/32单克隆抗体 美国BioLegend公司
PerCP-Cy5.5标记的抗小鼠CD86单克隆抗体 美国BioLegend公司
APC标记的抗小鼠CD23单克隆抗体 美国BioLegend公司
APC标记的抗小鼠CD206单克隆抗体 美国BioLegend公司
Mini免疫磁珠细胞分选仪 德国Miltenyi公司
CD11b磁珠 德国Miltenyi公司
神经组织分离试剂盒 德国Miltenyi公司
MS磁柱 德国Miltenyi公司
Cy3 标记的山羊抗兔 IgG 美国 Jackson ImmunoResearch 公司
FITC 标记的山羊抗小鼠 IgG 美国 Jackson ImmunoResearch 公司
AlexaFluor488标记的山羊抗兔 IgG 美国 Jackson ImmunoResearch 公司
AlexaFluor647标记的驴抗小鼠 IgG 美国 Jackson ImmunoResearch 公司
FITC 标记的驴抗大鼠 IgG 美国 Jackson ImmunoResearch 公司
Cy3 标记的驴抗山羊 IgG 美国 Jackson ImmunoResearch 公司
DMEM/F12细胞培养基 美国Hyclone公司
DMEM/F12高糖培养基 美国Hyclone公司
胎牛血清 美国Hyclone公司
胰蛋白酶 碧云天生物科技有限公司
BSA 美国Sigma公司
LPS 美国Sigma公司
小鼠IL-1β ELISA检测试剂盒 达科为公司
小鼠TNF-α ELISA检测试剂盒 达科为公司
小鼠TGF-β ELISA检测试剂盒 达科为公司
小鼠IL-13 ELISA检测试剂盒 美国Abcam公司
MagExtractor®-mRNA 纯化试剂盒 日本 Toyobo 公司
ReverTra Ace®逆转录试剂盒 日本 Toyobo 公司
RNA引物 Invitrogen Biotechnology 公司
GAPDH 武汉谷歌生物科技有限公司
Trizol Reagent Invitrogen Life Technologies 公司
无水乙醇 国药集团化学试剂有限公司
三氯甲烷 国药集团化学试剂有限公司
异丙醇 国药集团化学试剂有限公司
SYBR gene PCR Master Mix 日本 Toyobo 公司
IL-4 Peorotech公司
IFN-γ Peorotech公司
Stattic Selleck公司
Human PDGF-AA Peorotech公司
Mouse-FGF-Basic Peorotech公司
N2 supplement(100×) 美国GIBCO公司
B27supplement (50×) 美国GIBCO公司
Mouse-CNTF Peorotech公司
T3 美国Sigma公司
羊抗小鼠Arginase-1多克隆抗体 美国Santa Cruz 公司
兔抗小鼠iNOS多克隆抗体 美国Abcam公司
AlexaFluor594标记的驴抗小鼠 IgG 美国 Jackson ImmunoResearch 公司
4.主要试剂的配置
4.1麻醉剂的配制
盐酸氯胺酮注射剂(2ml: 0.1g)   4ml
盐酸氯丙嗪注射液(1ml: 10mg)  2ml
无菌生理盐水                   4 ml   
装入无菌容器,4℃保存,注意有效期为一周
使用方法:按小鼠体重给药,腹腔注射,0.5ml/100g体重。
4.2免疫荧光染色相关试剂配制
(1)0.01M PBS
       NaCl               8g 
KCl                0.2g 
KH2PO4            0.24g 
Na2HPO4•12H2O     2.879g 
加超纯水定容至1000ml,调整pH为7.2-7.4,充分混匀后备用。
(2)4%多聚甲醛
        多聚甲醛   4g
        0.01M PBS  100ml
        4℃保存  现用现配
(3)0.25% Triton-X100破膜液
Triton-X100   250μl 
0.01M PBS    100ml 
调整pH值为7.2-7.4, 混匀后室温保存备用。 
(4)抗体封闭液
BSA              1g 
0.25% Triton-X100  10ml 
调整pH值为7.2-7.4, 分装后放于-20ºC冰箱中保存。
(5)抗体稀释液 
        BSA               0.5g 
0.25% Triton-X100   10ml 
调整pH值为7.2-7.4, 分装后放入-20ºC冰箱中冻存。
(6)甘油封片剂 
甘油          50ml 
0.01M PBS     50ml 
  混匀溶解,用 0.22μm 的过滤器过滤,于常温保存。
4.3 FTY720药物配制
   体内实验FTY720使用终浓度为0.3mg/kg[14]
  (1)2ml无水乙醇溶将50mg的FTY720溶解为浓度为25mg/ml的储液,10µl分装,放于-20°C储存;
  (2)使用时,10ul储液,用无菌PBS稀释500倍;按0.3mg/kg浓度腹腔注射。
  体外实验FTY720使用终浓度为100nM[15]
  (1)2ml无水乙醇溶将50mg的FTY720溶解为浓度为25mg/ml的储液,一次性滤器过滤除菌,1ul分装,放于-20°C储存;
  (2)取出1ul储液,用无菌PBS稀释100倍;按1ml培养基加入1.4ul稀释后的储液使用。
注:整个步骤在超净台内完成。
4.4 Western Blot 相关试剂配制
 (1)5×SDS-PAGE上样缓冲液 
        0.5MTris.CI    5ml
        甘油          5ml
溴酚蓝        50mg
SDS          1g
     充分混匀分装成,使用时加入5%的β-琉基乙醇。
(2)1×转膜缓冲液液 
Tris-base    5.8g
甘氨酸     2.9g
SDS       0.37g
超纯水    800ml
     使用时甲醇200ml加入其中,4°C预冷后使用。
  (3)1×Tris-甘氨酸电泳缓冲液(PH8.3)
Tris-base    3.03g
甘氨酸     18.77g
SDS        1g
超纯水     1000ml
  (4)1×TBS    
           NaCI        8g
KCI        0.2g
Tris-base     3g
超纯水     1000ml
使用时加入500ul的Tween-20,调整Ph为7.2-7.4。
  (5)封闭液
5%脱脂牛奶   5g
TBST         100ml
        现配现用
(6)抗体稀释液  现配的TBST溶液溶解5%BSA。
4.5  IFN-γ,IL-4,LPS的配制:
(1)IFN-γ的配制:20µg的IFN-γ用含15%FBS的2ml高糖培养基溶解,使用时按1:500的比例稀释(工作浓度为20ng/ml);
(2)IL-4的配制:20µg的IL-4用含15%FBS的2ml高糖培养基溶解,使用时按1:500的比例稀释(工作浓度为20ng/ml);
(3)LPS的配制:10mg的LPS用用含15%FBS的2ml高糖培养基溶解为浓度为5mg/ml的储液;取40µl储液稀释到2ml含15%FBS的高糖培养基中得浓度为100µg/ml的储液,使用时按1:1000的比例稀释100µg/ml的储液(工作浓度为100ng/ml)。
注:上述液体分装后于-20℃储存,避免反复冻融,频繁使用可在4℃冰箱存放数天。
4.6 OPCs培养基(50ml):
DMEM/F12 50ml
N2 supplement(100×) 0.5ml
B27supplement (50×) 1ml
10ng/mlPDGF-AA 5µl
10ng/mlFGF-Basic 5µl
4.7 OPCs分化培养基(50ml):
DMEM/F12 50ml
N2 supplement(100×) 0.5ml
B27supplement (50×) 1ml
10ng/ml CNTF 5µl
30ng/ml T3 75µl
4.8多聚赖氨酸液的配制:使用浓度为0.lmg/ml
a. 取1ml三蒸水充分溶解25mg粉末状多聚赖氨酸,将溶液转移至50ml离心管中;
b. 再取1ml三蒸水清洗包装盒中残存的多聚赖氨酸,转移至50ml离心管中;
c. 取23ml三蒸水于50ml离心管中充分混匀,一次性滤器过滤除菌,1mg/ml储液5ml分装存放于-20℃冰箱; 
d. 取5ml储液,用45ml灭菌的双蒸水配成0.1mg/ml多聚赖氨酸使用液。
注:整个步骤在超净台内完成。
4.9盖玻片的包被:
   第一天将玻片泡酸过夜,第二天取出用自来水逐片冲洗,然后双蒸水浸泡过夜,浸泡后晾放于玻片盒内低温烘干。再用无水乙醇浸泡过夜,再晾于放于玻片盒内低温烘干。最后将玻片盒用锡箔纸包紧,放入高温(180℃)烤箱中烘烤两个小时后备用。
5.实验方法
5.1小鼠 BCAS模型建立
(1)麻醉:清洁级雄性C57 小鼠称重,固定,按0.5ml/100g 体重剂量腹腔注射异丙嗪及氯胺酮复合麻药,注意误入血管和肠管;
(2)固定:用胶带将小鼠固定于手术台,再固定小鼠上下肢,将颈部垫高让小鼠充分后仰暴露出手术部位,注意牵出舌头防止舌后坠;
(3)手术步骤:颈部备皮,消毒,在小鼠颈部正中位置切口,将两侧颌下腺等软组织钝性分离,并将两侧胸锁乳突肌用手术丝线牵引,在外科显微镜下将胸骨舌骨肌三角区暴露出来,颈总动脉在动脉分叉处下方的动脉鞘内缓慢分离出,长约 1cm,注意尽量避免伤及迷走神经,并且要密切关注小鼠生命体征;
(4)将双侧颈总动脉狭窄:一手用显微镊将颈总动脉稍提起,另一手将microcoil 旋转、套扎到动脉上,套扎完成后上下移动coil以保正套扎成功,注意剥离干净软组织,旋转 microcoil时要准确、迅速,尽量不要刺伤血管和神经,完成一侧后就可马上套扎另一侧,整体手术时间不要超过 10min;
(5)完成颈总动脉狭窄后,整理好组织,缝皮,消毒;
(6)手术完成后,将小鼠放回笼中,等其自然苏醒,正常饮食。手术时,注意利用保温垫使肛温保持在 37±0.5℃。
5.2给药
  于造模后 24 小时,治疗组给予 0.3mg/kg 的FTY720腹腔注射,每天 1 次,连续 3天,10天及1个月。对于需要进行 BrdU 染色的小鼠,均于造模14天开始腹腔注射 BrdU(100mg/kg),每天 1次,连续14天直到小鼠处死时为止。 
5.3小胶质细胞及少突胶质前体细胞的原代培养及纯化:
(1)原代细胞的培养:
      a.根据文献[16-17]方法改进,进行小鼠小胶质细胞及少突胶质前体细胞的原代培养。取出生0-3天的C57乳鼠,在无菌条件下取出小鼠全脑;
      b.取出后放入冰D-hank' s液中反复冲洗以去除血污;
      c.在超净工作台内去除小脑,仔细剔除脑膜,将脑组织用眼科剪剪成小块;
      d.用0.125%胰酶37°C消化组织块15分钟;
      e. 用培养基(DMEM/F12培养基含20%胎牛血清)终止消化,巴氏管吹打分散组织块为细胞悬液,用100 目钢丝筛网过滤;
      f.4°C离心 (800rpm)细胞悬液8min,去上清;
      g. 用培养基(DMEM/F12培养基含20%胎牛血清)重悬沉淀的细胞,按照106密度将细胞悬液接种于T75细胞培养瓶中:
      h. 培养瓶置于含95% O2 、5% CO2的37℃细胞孵育箱培养,第3天将培养基更换为DMEM/高糖培养基(含20%胎牛血清),以后每4天换一次半液;
      i.培养箱中培养到原代培养的混合胶质细胞长满(约10-12天)。
(2)小胶质细胞的纯化:
      a.原代培养的混合胶质细胞长满后,拧紧瓶盖,用Ep手套和保鲜袋包裹防治污染;将培养瓶培养面朝下固定在恒温水平摇床上,37°C下250rpm震摇2h ;
      b.取下培养瓶,收集上清液并混合;
      c.4℃800rpm离心上清液8min,去上清,保留管底细胞团;
      d.用含20%胎牛血清的DMEM/高糖培养基重置细胞,按照合适密度均匀种植于细胞培养板用于后续实验。
(3)少突胶质前体细胞的纯化:
 a.按上述方式纯化下小胶质细胞后,更换培养基,继续37℃恒温摇床振摇(180rpm,18h);
 b.振摇18h后取细胞上清于100mm培养皿中,置于37℃ 5% CO2、95% O2培养箱中差速贴壁40min,去除多余的星形胶质细胞及小胶质细胞;
 c.取培养皿中的上清于离心管中4℃离心(800rpm)8min,弃去上清后,细胞沉淀用OPCs培养基重悬。
 d.细胞按适宜密度接种于铺有盖玻片(多聚赖氨酸包被)的24孔板中;
 e.细胞接种后隔天换液,接种后3天干预。
(4)少突胶质前体细胞的诱导分化:
纯化3天后的OPCs细胞更换为分化培养基及干预培养基,诱导分化三天,收集细胞爬片用于免疫荧光染色。
5.4细胞的相关干预:
(1)小胶质细胞的干预:
  a.纯化的小胶质细胞种植于6孔板中24h后按如下分组进行干预:未刺激组(M0组),LPS plus IFNγ组(M1组),LPS plus IFNγplus FTY720组,LPS plus IFNγplus FTY720plus stattic(使用浓度为10nM)组,IL-4组(M2组);
  b.上述细胞干预24h后收集细胞及细胞上清用于下游实验。
(2)少突胶质前体细胞的干预:
     a.纯化3天后的OPCs细胞用干预后的小胶质细胞上清(MG培养基)和OPCs 培   养基或OPCs分化培养基(比例为1:1)培养3天。分组如下:OPCs培养基或OPCs分化培养基组;M0小胶质细胞上清液+OPCs培养基组(或OPCs分化培养基);M1小胶质细胞上清液+OPCs培养基组(或OPCs分化培养基);M1+FTY720小胶质细胞上清液+OPCs培养基组(或OPCs分化培养基);M1小胶质细胞上清液+单独预处理后的FTY720培养基+OPCs培养基组(或OPCs分化培养基);M2小胶质细胞上清液+OPCs培养基组(或OPCs分化培养基);
     b.OPCs细胞培养3天后,收集细胞爬片用于免疫荧光染色。
   5.5免疫荧光染色
  组织切片免疫荧光染色
 (1)染色前处理
  1)标本收集
   BCAS术后按不同时间点取脑(3天,10 天,1 个月)。麻醉小鼠后,从左心室灌注37℃预热的生理盐水,持续缓慢推注5min,共推注20ml生理盐水,然后断头快速取脑,放入-80 ℃的异戊烷中10min后用锡纸包裹,-80℃冰箱保存。使用前用冰冻切片机切脑组织切片,保证切片厚度为10μm,然后将其贴附到多聚赖氨酸包被过的玻片上,晾干后放到-80 ℃冰箱中保存。
2)切片准备
  将小鼠大脑用冰冻切片机进行冠状面切片,厚度为 10µm;切片分组后将其保存于-80℃ 冰箱中备用,注意取相同位置的切片进行染色。
(2)染色步骤:
 a.把切片从-80 度冰箱中取出,然后梯度降温到室温;将小鼠脑组织标本用4℃预冷的多聚甲醛溶液固定,固定时间为15min;
 b.弃去多聚甲醛溶液,1×PBS 洗 3 次,每次 10 分钟;
 c.用滤纸吸干切片上残留的水,组化笔在织切片周围画一个圆圈(防止染色过程中液体流出玻片); 
 d.滴加破膜液,室温孵育15min;
 e.1×PBS 洗 3 次,每次10分钟;
 f.用滤纸吸干切片上残留的水,滴加封闭液,室温封闭 1-2 小时;
 g.1×PBS 洗 3 次,每次10分钟;
 h.用滤纸吸干切片上残留的水,用抗体稀释液将一抗依照相应的比例稀释,再滴加在组化圈内,在4℃条件下湿盒内孵育过夜(>16 小时);
 i.1×PBS 洗 3 次,每次10分钟;
 j.用滤纸吸干切片上残留的水,用抗体稀释液将二抗依照相应的比例稀释,如需染核可同时加入DAPI,室温避光孵育1h;
 k.1×PBS 洗 3 次,每次 10 分钟,注意避光操作;
 l.用滤纸吸干切片上残留的水,用50%的甘油封片后荧光显微镜下观察。
注:一抗的稀释比例为:Iba-1(1:500);CC1(1:200)MAG(1;100);MBP(1:100);Brdu(1:200);Olig-2(1:200);CD68(1:200);CD16/32(1:200);CD206( 1:200);NF(1:100);
 二抗的稀释比例为:Cy3 标记的山羊抗兔 IgG、FITC 标记的山羊抗小鼠 IgG、AlexaFluor488标记的山羊抗兔 IgG、AlexaFluor647标记的驴抗小鼠 IgG、FITC 标记的驴抗大鼠 IgG、Cy3 标记的驴抗山羊 IgG:1:200
细胞爬片免疫荧光染色:
a.弃去细胞培养基,用1×PBS 洗三次;再用4℃预冷的多聚甲醛溶液固定细胞爬片,固定时间 15min
 b.弃掉多聚甲醛溶液,1×PBS 洗 3 次,每次 10 分钟;
 c.滴加破膜液,室温孵育15min; 
 d.1×PBS 洗 3 次,每次7分钟;
 e.滴加封闭液,室温封闭 1小时;
 f.1×PBS 洗 3 次,每次7分钟;
 g.用抗体稀释液将一抗按照相应的比例稀释,滴加在细胞爬片上,4℃条件下在湿盒内孵育过夜(>16 小时);
 h.1×PBS 洗 3 次,每次 10分钟;
 i用抗体稀释液.将二抗按照相应的比例稀释,如需染核可同时加入DAPI,滴加在细胞爬片上,室温避光孵育 1h;
j.1×PBS 洗 3 次,每次 10 分钟,注意避光操作;
k.用50%的甘油封片后荧光显微镜下观察。
注:一抗的稀释比例为:Iba1(1:500);Olig2(1:200); MBP( 1:200);
二抗的稀释比例为Cy3 标记的山羊抗兔 IgG(1:200);FITC 标记的山羊抗小鼠 IgG(1:200);Cy3 标记的山羊抗大鼠 IgG(1:200)
照片采集与分析处理:
照片通过激光共聚焦显微镜或普通荧光显微镜采集。激发/发射波长为360/460nm的DAPI呈蓝色荧光;FITC的激发/发射波长为488/525nm,呈绿色荧光,激发/发射波长为550/565nm的Cy3呈红色荧光,每张载玻片中选择不同的白质区域,每个样本至少采集4张照片,每组至少5只小鼠。细胞爬片,每张盖玻片任意选择5个部位采集照片。所有的图片均应在相同的参数下采集。
5.6Luxol Fast Blue(LFB)染色
(1)把切片从-80℃冰箱中拿出,梯度降温至室温;
(2)挑出脑片,于抗原修复盒中将小鼠脑组织标本用4℃预冷的多聚甲醛溶液固定,固定时间15min;
(3)弃掉多聚甲醛溶液,1× PBS 清洗 3 次,每次 10 分钟;
(4)用自来水、ddH2O各自振荡清洗10 分钟;
(5)预先将75/95/100%的乙醇准备好;
(6)将洗好的切片从 75%乙醇开始,按每个浓度2分钟脱水,直到 100%乙醇为止;
(7)将洗好的切片放入LFB 液中,然后放到60℃的烤箱孵化8-10h;
(8)将孵化好的切片取出,室温冷却,再用流水冲洗 5 分钟,但水流不要太大,以免冲毁脑片,清洗掉切片残余的染液后用75%乙醇漂洗1-2遍; 
(9)用0.05%Li2CO3 分色,时间根据实验情况调整,初次分色不应超过 10 秒,用75%乙醇和 0.05%Li2CO3 反复洗,显微镜观察着色和分色情况;
(10)梯度(75/95/100%)酒精脱水、然后二甲苯透明15min,最后中性树胶封片。
说明:正常髓鞘为蓝色,脱髓鞘则白质区域不着色。根据 Wakita H的研究对LFB 染色进行分级
                  LFB白质损伤程度分级[18]:
0级 正常
1级 神经纤维排列紊乱
2级 空泡形成
3级 髓鞘脱失
 
5.7 Werstern blot检测
(1) 组织蛋白的提取
 a. 从-80°C冰箱中将不同时间点的标本拿出,待稍复温后取脑白质组织称重,  按照每0.1g加1ml RIPA裂解液(含1%蛋白酶抑制剂混合物cooktail)中,放于 冰上,用匀浆器充分匀浆,直至碾碎;
 b.将浑浊液冰上裂解30分钟,超声裂解3次,每次持续5s;
 c.4°C,12000rpm离心10min;
 d.吸出上清液到另一1.5mlEP管中。
(2)细胞总蛋白的提取:
a.在小胶质细胞干预24h后,从培养箱取出6孔板, 弃去培养基;
b.用PBS 轻洗细胞两次;
c.完全弃去液体后加入100µ1的RIPA裂解液(含 1%蛋白酶抑制剂混合物):
d.用细胞刮刮下细胞裂解物, 然后收集到1.5ml Ep 管;
e.冰上放置 30min;
f.4°C 下 12000rpm 离心 10min;然后收集上清转入到另一个新的EP管中。
(3)蛋白浓度的测定
    利用BCA法检测蛋白浓度:
  a.制作标准曲线:1mlPBS磷酸盐缓冲液中加入10mg干冻标准品配成10mg/ml  的储液,分装后,放到-40°C冰箱冻存,使用时按需要稀释储液。
b.取20ul配置好的蛋白样品按顺序加入酶标板中;
c.取1ul蛋白,用0.9%生理盐水稀释20倍,按照顺序加入酶标板中;
d.每孔加入 200μL BCA 工作液,充分混匀;
e.37°C孵育30分钟,室温放置5-10min终止反应;562nm波长测定吸光度值;
f.通过CurveExpert 3.0软件建立标准曲线以及计算实际浓度;
g.按每个样品总上样蛋白量40μg计算出总上样体积数。
(4)SDS-PAGE凝胶的制备
a. 洗板:清洗玻璃板、吹风机吹干后安装到垂直电泳槽中,操作时要使两玻璃对齐,以免漏胶;
b. 制备12%分离胶10ml
双蒸水                    3.3ml
30%丙烯酰胺                4ml
1.5mol/L Tris.cl (PH 8.8)      2.5ml
10% SDS                  0.1ml
10% 过硫酸胺             0.1ml
TIMED                     5μl
c.混匀液体后迅速将液体加入到电泳槽两玻璃板的间隙,加至距顶短板上缘约2cm处;
d.再用移液枪轻轻在分离胶上加满双蒸水,垂直放置于室温30min;
e.待分离胶完全凝固后,倾出双蒸水,并用滤纸吸干残留水;
f.制备 5ml 5%浓缩胶
双蒸水                   3.4ml
30%丙烯酰胺             0.83ml
1.0mol/L Tris.cl (PH 6.8)    0.63ml
10% SDS                 0.05ml
10% 过硫酸胺            0.05ml
TIMED                   5μl
g.快速混匀液体后,将浓缩胶加入两玻璃板的间隙,然后插入干净的 Teflon 梳子,注意避免产生气泡;
h.待浓缩胶凝固后(约 30min),缓慢垂直拔出梳子形成加样孔,用滤纸吸干残留液体。
(5)蛋白电泳
a. 将Tris-甘氨酸电泳缓冲液分别加入垂直电泳槽内、外;
b.用微量注射器取蛋白样品,第一孔和最后一孔加2微升蛋白marker;其余孔
按预定的顺序每孔加40μg蛋白;
c. 调整电压为 80V恒压进行电泳;
d. 当溴酚蓝染液进入分离胶时,调整为120V继续电泳,直到溴酚蓝到达分离胶底部终止电泳,关闭电源。
(6)蛋白转移与免疫检测
a. 准备6张滤纸和1张PVDF膜(大小和凝胶一致),剪去一角作标记;
b. 将滤纸、PVDF膜、凝胶及海绵垫放在转移缓冲液中;
c. 从阳极开始,按海绵垫、3 张滤纸、PVDF膜、凝胶、3张滤纸、海绵垫的顺序精确排放到干净转膜夹中,用玻璃棒小心赶走气泡;
d. 将转膜夹放入转膜槽内然后加入足量转膜液;
e. 接通电源,调整电流为220mA电泳转移120min
f. 转膜结束后,将PVDF膜放入加有20ml封闭液的封闭盒中,室温缓慢摇动至2h;
g. 弃去封闭液,TBST 漂洗3 次×5min;孵育一抗,一抗稀释比为:MAG(1:1000), MBP(1:100),iNOS(1:10),CD16/32(1:500),Arginase-1(1:200),CD206(1:1000),GAPDH(1:800),4℃孵育过夜;
h. TBST 漂洗膜3次,每次10min;孵育二抗,,一抗稀释比为HRP标记羊抗小鼠IgG(1:800),HRP标记羊抗兔IgG(1:800),HRP标记驴抗山羊IgG(1:800),HRP标记驴抗大鼠IgG(1:800),室温孵育1h,TBST 漂洗膜 3次,每次10min;
i.等体积混匀ECL化学发光试剂盒A和B 两种试剂,均匀滴加到膜的蛋白面,保持1-2min,去尽残液,保鲜膜塑封,放入凝胶成像仪中曝光成像。利用imagelab 软件处理系统分析目标带的光密度值。
5.8八臂迷宫行为学试验
(1)八臂迷宫设备:是一“ 米 ”字形等角八臂,在其中央有一公共平台,而且通过可控小门与各臂相连,使用时对每个臂进行固定编号(1-8),并且将不同的参照物放置在迷宫周围,每臂末端放置适量食饵。
(2)造模前学习能力训练:在每条臂末端放置食饵,然后将小鼠放入中央平台,打开小门 ,让小鼠在迷宫内自由觅食 5min。此种方式预适应 3 天,小鼠在每天迷宫实验前12h 开始禁食,以便排除动物饱食状况的干扰。 
(3)造模后行为学检测:采用 Shibata M[19]报道的八臂迷宫实验方法进行改进,BCAS1个月及FTY720干预1个月后适应 3 天,八臂末端内都放置食饵,将小鼠放入中央平台,打开小门 ,让小鼠在迷宫内自由觅食5min。第 4 天起记录小鼠前8次访问不同臂的个数(first eight arm choice),同时还要记录小鼠吃完八臂内食物时所有重复访问次数(revisiting errors)一直到第 10 天,以上记为工作记忆错误(working memory error, WME);从第 11 天起在固定的 2,4,6,8号臂内放置食饵,让小鼠自由觅食,记录吃到这几个臂内食饵前小鼠所犯的错误,这记为参考记忆错误(referrence memory error, RME)。两种行为学检测方法都以吃完食饵或15分钟结束做为一次试验。
(4)每组至少8只小鼠,检测完成后进行不同组间记忆错误次数的比较,并进行统计学分析。
5.9免疫磁珠阳性分选小胶质细胞
  (1)小鼠脑单细胞悬液的制备:利用神经组织分离试剂盒分离出脑白质的神经细胞:
a.使用前先37℃预热1950µl混合酶Ⅰ,15min;
b.麻醉好小鼠后,立即断头取脑,把大脑放入装有无菌PBS的35mm培养皿中,剥掉脑膜,取出脑白质,将脑白质切成小块状转入装有1ml无菌PBS的离心管中;
c.室温离心300g×2min,弃去上清液;
d.把混合酶1加入脑组织中,充分混合后,37℃震荡孵育15min;
e.准备混合酶Ⅱ30µl,然后加入到样本中,充分混合,用200µl枪头吹打组织10次(动作轻柔,不要产生气泡);
f.37℃震荡孵育10min;
g.用200µl枪头吹打组织10次(动作轻柔,不要产生气泡);
h.重复步骤g;
i.用75µm一次性滤网将细胞悬液过滤到5ml离心管中,过滤两次;
j.室温离心300g×10min,弃去上清液,加入1ml磁珠分选缓冲液重悬细胞。
 (2)阳选小胶质细胞:
   a.室温离心300g×10min小鼠脑组织单细胞悬液,弃去上清液;
   b.按每107细胞加入90 µl磁珠分选用缓冲液和10 µl CDl 1 b 磁珠,混匀后于4℃避光孵育15 min;
  c.加入孵育体系10倍体积的磁珠分选缓冲液,4℃、1200 rpm离心10 min;
  d.用MS型号的分选柱经润柱、上样、洗柱 3步后,收集磁珠分选柱上阳性细胞成分。
5.10流式细胞仪检测分离出的小胶质细胞的表型:
 a.将分选出的小胶质细胞1000rpm离心5min;
 b.加流式抗体PE-CD11b(5µl),PerCP-Cy5.5-CD86(5µl),PerCP-Cy5.5-CD16/32 (1.25µl),APC-CD23(2.5µl),APC-CD206(2.5µl)到100µl无菌PBS中2-8℃避光孵育30min;
c.1000rpm离心5min,弃去上清;
d.加入300µlPBS,1000rpm离心5min,弃去上清;
e.加入200µlPBS重悬细胞,上机检测。
5.11 ELISA检测
根据说明书进行操作,基本操作过程如下:
(1)收集上清液:小胶质细胞干预24h后,收集细胞上清液;
(2)去除漂浮细胞等杂质:4°C 下 1200rmp离心20min 后收集上清,分装保存于-80℃冰箱, 一次性使用,不反复冻融。
(3)标准品配制:通过倍比稀释配制标准品浓度梯度为:2000pg/ml、1000pg/ml、500pg/ml、250pg/ml、125pg/ml、62.5pg/ml、3lpg/ml和15pg/ml。
(4)使用前,准备试剂工作液,室温平衡20-30min;根据试验孔数目配足试剂,将所有试剂充分混匀;
(5)根据实验孔(空白和标准品)数量,确定所需的板条数目。
(6)加样:100µ1每孔加入配制后的标准品、样品和空白对照。盖上封板膜,室温下孵育1h-2h;
(7)洗板:扣去孔内液体,300 μL/well 加入1×洗涤缓冲液;停留1 分钟后弃去孔内液体。重复4 次,每一次在滤纸上扣干;
(8)加检测抗体:每孔加入50μL稀释后的Biotinylated antibody。混匀后,盖上封板膜,37℃温育90 分钟;
(9)洗板:重复步骤(7);
(10)加酶:每孔加入100μL稀释后的Streptavidin-HRP。盖上封板膜,37℃温育30 分钟;
(11)洗板:重复步骤(7);
(12)显色:每孔加入100μLTMB,37℃避光温育5-30 分钟之间,根据孔内颜色的深浅(深蓝色)来判定终止反应。通常显色10- 20 分钟可以达到很好的效果;
 (13)终止反应:每孔迅速加入100μLStop solution 终止反应;
(14)读板:终止后10分钟内,用检测波长450 nm 读值。
5.12 RT-PCR
(1)提取细胞总的RNA:
a.小胶质细胞干预24h后,弃去培养基,用1×PBS洗两遍后,加入1mlTrizol 溶液到6孔板中,用1ml移液器吹打细胞,充分裂解细胞,将细胞裂解液移入1.5mlEP管;
b.加入200µl的氯仿于EP管中,用力摇匀,室温静置10min;静置后,发现最上层为无色水相,中间层为白色蛋白相,下层为粉红色液体相;
c.4℃离心,12000rpm,15分钟;
d.移取上清液约 500µl至新的EP管,加入约 0.5ml 异丙醇,混匀后,室温放置10分钟;
e.4℃离心,12000rpm,10分钟;
f.加入1ml 75%乙醇洗涤管底沉淀,4℃离心,8500rpm,7分钟;
g.吸除上清液,将沉淀物置于超净台上吹10-15分钟;
h.加入 20μl DEPC 水溶解 RNA。
(2)逆转录:
按TOYOBO逆转录试剂盒说明书操作, 基本流程如下:
a.RNA变性:把RNA在65℃条件下热变性5min 后,立即放于冰上冷却。
b.反应液的配制:
Nuclease-free Water up to 20µ1
5 ×RT Buffer 4µl
RT Enzyme Mix 1µl
Primer Mix 1µl
RNA 1pg-2µg
Total volume 20µl
c.逆转录反应
1)在37℃条件下,进行15min的逆转录反应;
2)在98℃条件下, 进行5min的酶失活反应;
3)反应结束之后, 保存于4℃或者-20℃(储存)。
(3)PCR检测:
a.引物序列:
Gene Forward Primer Reverse Primer
GAPDH AGGAGCGAGACCCCACTAACA AGGGGGGCTAAGCAGTTGGT
iNOS GCTTGTCTCTGGGTCCTCTG
CTCACTGGGACAGCACAGAA
 
CD32   AATCCTGCCGTTCCTACTGATC
GTGTCACCGTGTCTTCCTTGAG
CD86 GACCGTTGTGTGTGTTCTGG GATGAGCAGCATCACAAGGA
TNF-α ACGGCATGGATCTCAAAGAC
AGATAGCAAATCGGCTGACG
 
IL-1β TGTCTTGGCCGAGGACTAAGG TGGGCTGGACTGTTTCTAATGC
 
CD206   TCAGCTATTGGACGCGAGGCA
TCCGGGTTGCAAGTTGCCGT
 
Arg1 TTAGGCCAAGGTGCTTGCTGCC TACCATGGCCCTGAGGAGGTTC
 
IL-10 GGCAGAGAACCATGGCCCAGAA AATCGATGACAGCGCCTCAGCC
 
TGF-β TGCGCTTGCAGAGATTAAAA
CGTCAAAAGACAGCCACTCA
 
Ym1/2 ACCCCTGCCTGTGTACTCACCT
CACTGAACGGGGCAGGTCCAAA
 
MSX3 GCCGCTGATGCTCCTGGTA TGGGCAAGGTTTTAGGAAGGT
IRF3 ACGGCAGGACGACACGAT
TCAGCAGCTAACCGCAACAC
IRF4 AGGTGACTCTGTGCTTTGGTGA GGGAGCGGTGGTAATCTGG
STAT3 GTACAAAGGCACTCCATCAGC CCCCATATCGTCTGAAACTCC
STAT6   GCTGGACAGACCTACAGACCC GGCGTTGTGGAAAGTCAACATA
 
PPARG CCACAGTTGATTTCTCCAGCAT TCCCCACAGACTCGGCAC
 
JAK1 AGACTGAGGTGAAGCAGGTGG
CAGGGCGAAGAGGTTGTGA
JAK2 GCTCCTCTGCTTGATGACTTTG ACAGCCAGTGGAGTCTGGTCT
 
JAK3 CCTGCGGTTGGTGATGGA GCAGTAGGCCGTCGGTCGGTGT
 
b.PCR 反应体系:
2×PCR mastermix 10µl
cDNA 2µl
引物 上下游引物各1µl
ddH2O 6µl
c.扩整过程:94 ℃预变性10min; (94℃ 变性 45S, 56℃ 退火 30s, 72℃延伸 30s)× 35 个循环: 72℃ 延伸 lOmin。
结果采用2-ΔΔCt法进行处理。
6.统计学处理方法
经过各种干预处理后对结果进行汇总分析,所得数据用均数±标准差;统计应用 SPSS19.0 软件包,组间比较采用单因素方差分析,以P<0.05为有统计学意义。
 
                       实验结果
1. FTY720对小鼠低灌注损伤后认知功能变化的影响
    小鼠脑白质低灌注损伤模型(BCAS)成功建立后,对小鼠认知能力进行行为学测试:利用八臂迷宫行为学方法检测 BCAS 术1个月后小鼠的参考记忆错误和工作记忆错误。结果显示FTY720治疗组小鼠吃完八臂内食物的所有重复访问次数(revisiting errors)(Fig1A)明显低于单纯BCAS造模组而高于假手术(Sham)组,前 8 次访问不同臂的个数(first eight arm choice) (Fig1 B)多于单纯BCAS造模组而少于 Sham 组,提示FYY72治疗可以减少低灌注造成的工作记忆错误(working memory error, WME),减轻小鼠短时记忆受损;三组小鼠在完成四个固定臂内食饵任务时所犯错误没有明显差异,提示参考记忆错误(referrence memory error, RME)(Fig1 C)无明显变化,BCAS术后小鼠长时记忆未见明显损伤。
 
                 
Fig 1.八臂迷宫行为学检测:假手术组、BCAS组、FTY720干预组,n=8;A 重复访问次数(revisiting errors),P<0.001;B 前 8 次访问不同臂的个数(first eight arm choice),P=0.023;C 参考记忆错误(referrence memory error, RME),P=0.308.
2 .FTY720对小鼠低灌注后白质区髓鞘结构改变的影响
    对假手术组(sham组)、BCAS 组及FTY720干预后的BCAS 组1个月的小鼠脑片进行LFB 髓鞘染色,对其损伤程度进行评分。
不同白质区域 LFB 髓鞘染色结果显示:FTY720治疗组小鼠可以减轻 BCAS 组小鼠在胼胝体中央区(CCm)、前联合(AC)、新纹状体(CPu)和内囊(IC)等区域中白质纤维束中的髓鞘脱失、白质纤维排列紊乱、空泡形成等白质损伤,与BCAS单纯造模组相比海马伞端(F)的白质损伤也有一定的减轻,但无明显统计学差异(Fig2)。
               
          
                          
                                                             Fig 2.FTY720在BCAS术后不同白质区域 LFB 髓鞘染色结果:胼胝体中央区(CCm)、新纹状体(CPu)、前联合(AC)、内囊(IC)、海马伞端(F)等位置在sham组、BCAS组、FTY720干预组LFB染色结果,*P <0.05,**P < 0.01,#P<0.05##P<0.01.
3. FTY720对低灌注后不同时间点轴突以及髓鞘结构完整性的动态变化的影响
    采用免疫荧光染色技术检测小鼠 BCAS术后1个月胼胝体中央区神经纤维(NeuroFilamen,NF)、髓鞘相关糖蛋白(Myelin Associated Glycoprtein, MAG)、髓鞘相关碱性蛋白(Myelin Basic Protein, MBP)的变化,结果显示,BCAS 术后NF、MBP、MAG的荧光强度较假手术组减弱,而FTY720干预后,荧光强度较单纯的BCAS手术组增强(Fig4)。
    利用Western blot技术检测小鼠 BCAS 术后 3 天、10 天、1 个月胼胝体中央区髓鞘相关碱性蛋白(Myelin Basic Protein, MBP)和髓鞘相关糖蛋白(Myelin Associated Glycoprtein, MAG)的动态表达变化,发现与 FTY720干预组相比,Vehicle组MBP 蛋白表达量随着低灌注损伤时间延长表达降低,并且在1 个月时下降幅度最大,但无统计学意义,(Fig3 B和 D),与 FTY720干预组相比,Vehicle组MAG 从 BCAS术后第3天起表达开始降低,丢失纤维束样结构,染色为非连续性,其蛋白表达量在低灌注 1 个月的时候降到最低,并且降低趋势具有统计学意义(Fig3 B和 C)。
 
 
Fig3.FTY720在BCAS术后不同时间点髓鞘结构及轴突纤维的动态变化A:NF、MBP、MAG 荧光强度免疫荧光染色图,Scale bar, 100µm;B:MBP、MAG蛋白量动态变化图;C:MAG蛋白表达量统计图,n=8,**P < 0.01,#P<0.05##P<0.01,有统计学意义;D.MBP蛋白表达量统计图,n=8,无统计学意义。
4. FTY720对低灌注后脑白质区少突胶质细胞存活、增殖、分化的影响
采用免疫荧光染色的方法检测FTY720对低灌注后少成熟突胶质细胞存活、增殖、分化的影响。与 Sham 组相比,Vehicle 组低灌注 1 个月后,少突胶质细胞数量及分化的少突胶质细胞数明显减低,FTY720干预后,低灌注后的少突胶质细胞数目及分化的少突胶质细胞数高于 Vehicle组,与 Vehicle组相比,FTY720干预组增殖的少突胶质细胞及增殖分化的少突胶质细胞数明显增多,提示FTY720干预可显著减少低灌注后成熟少突胶质细胞的丢失及促进少突胶质细胞增殖分化。(Fig4)。
      
Fig4.FTY720在BCAS术后白质区域少突胶质细胞活化、增殖、分化的改变A:Olig2、APC、Brdu、DAPI共染免疫荧光染色图,Scale bar, 30µm;B:Olig2细胞数统计图,n=6,#P<0.05,**P < 0.01;C:Olig2与Brdu免疫荧光双标细胞数统计图,n=6,#P<0.05;D:APC细胞数统计图,n=6,#P<0.05,**P < 0.01;E:APC与Brdu免疫荧光双标细胞数统计图,n=6,*P <0.05,##P<0.01。
5. FTY720对低灌注后小胶质细胞活化的影响
采用Iba1、CD68免疫荧光的方法检测FTY720对低灌注3 天、10 天、1 个月后小胶质细胞活化及吞噬的影响,结果发现Vehicle 组低灌注后,小胶质细胞明显活化,吞噬增多,表现为小胶质细胞数目增多,细胞胞体变大,突起增多;与 Vehicle 组相比,FTY720干预组低灌注后缺血白质区小胶质细胞数目减少及吞噬指标CD68表达明显降低,提示FTY720干预可抑制低灌注后小胶质细胞的活化、吞噬(Fig5)。
     
Fig5.FTY720在BCAS术后不同时间点小胶质细胞的改变A:FTY720干预后,Iba1与DAPI共染示意图,CD68与DAPI共染示意图Scale bar, 50µm;B:Iba1与DAPI免疫荧光双标细胞数统计图,n=6,#P<0.05,##P<0.01,**P < 0.01;C:CD68与DAPI免疫荧光双标细胞数统计图,n=6,#P<0.05,##P<0.01,**P < 0.01。
6 .FTY720对低灌注后小胶质细胞表型的影响
    采用免疫荧光检测FTY720对低灌注3 天、 10 天、 1 个月后小胶质细胞表型的影响,结果显示:与 Sham 组相比,Vehicle组的 M1型标志物 CD16/32的表达明显增高,M2型标志物CD206表达降低。予以FTY720干预后,M1型指标CD16/32的表达较 Vehicle 组明显降低,差异具有统计学意义。但M2型指标CD206的表达仅在造模后 1月时显著降低,有统计学意义,而在造模后 3天,10天时相比 Vehicle 组无显著差异(Fig6)。
通过免疫磁珠分选流式细胞染色法检测FTY720对低灌注10 天、 1 个月后小胶质细胞表型的影响,结果显示:予以FTY720干预后,M1型指标CD16/32,CD86的表达较 Vehicle 组明显降低,差异具有统计学意义。但M2型指标CD206,CD23的表达较Vehicle 组相比,表达增多(Fig7)。提示FTY720干预可以调节小胶质细胞表型向M2型转化。
    
Fig6.FTY720在BCAS术后不同时间点小胶质细胞表型的改变A:FTY720干预后,Iba1与CD16/32共染代表图,Scale bar, 50µm;B:Iba1与CD206共染代表图,Scale bar, 50µm;C:Iba1与CD16/32共染细胞数统计图,n=6,#P<0.05,##P<0.01,**P < 0.01;D:Iba1与CD206共染细胞数统计图,n=6,##P<0.01;E:CD206与CD16/32细胞数比例统计图,#P<0.05,##P<0.01。
 
Fig7.FTY720在BCAS术后不同时间点(10天,1个月)小胶质细胞表型的改变A:FTY720干预后,小胶质细胞通过免疫磁珠分选流式细胞染色法检测其M1型标记物CD16/32、CD86的流式示意图,M2型标记物CD23、CD206的流式示意图;B:CD16/32与CD11b共标细胞数占总分选出的小胶质细胞数的百分比统计图,n=6,*P < 0.05,#P<0.05,##P<0.01;C:CD86与CD11b共标细胞数占总分选出的小胶质细胞数的百分比统计图,n=6,*P < 0.05,##P<0.01;D:CD206与CD11b共标细胞数占总分选出的小胶质细胞数的百分比统计图,n=6,#P<0.05,*P < 0.05,**P < 0.01;E:CD23与CD11b共标细胞数占总分选出的小胶质细胞数的百分比统计图,n=6,#P<0.05。
7.原代小胶质细胞及少突胶质前体细胞体外培养及鉴定:
      经过振摇法纯化小胶质细胞,振摇差速贴壁法纯化少突胶质前体细胞(OPCs)。采用Iba1与DAPI免疫荧光共染法鉴定小胶质细胞的纯度,小胶质细胞的纯度可达99%;Olig2与DAPI免疫荧光共染法鉴定OPCs的纯度,结果显示OPCs的纯度可达95%(Fig8)。
 
Fig8.免疫荧光双标染色技术鉴定小胶质细胞及OPCs的纯度A:Iba1与DAPI共染鉴定小胶质细胞纯度的代表图;B:Olig2与DAPI共染鉴定OPCs纯度的代表图。
8. FTY720在体外细胞实验中对小胶质细胞表型的影响
     体外培养原代小胶质细胞,分别通过LPS+IFN-γ或LPS+IFN-γ+FTY720或IL-4刺激。通过RT-PCR检测FTY720对小胶质细胞表型的影响,结果显示:LPS+IFNγ+FTY720干预比LPS+IFNγ刺激组的M1型小胶质细胞生物学标志物iNOS,CD86,TNF-α,CD32及IL-1β 的mRNA表达量低,LPS+IFNγ+FTY720干预比LPS+IFNγ刺激组M2型小胶质细胞生物学标志物Arg 1,CD206,YM,IL-10,TGF-β  的mRNA表达量高,与IL-4组比,这两组的M1型小胶质细胞生物学标志物mRNA表达量都较之要高,而M2型小胶质细胞生物学标志物的mRNA表达量较之要低,差异有统计学意义,提示FTY720干预可以促进M1型小胶质细胞向M2型小胶质细胞转化(Fig9)。
 
Fig9.在体外细胞实验中 FTY720干预后,小胶质细胞细胞表型的变化A、B、C、D、E:M1 标志物(CD86、iNOS、TNF-α、CD32、IL-1β)的 mRNA 表达水平统计图,#P<0.05,##P<0.01,*P < 0.05,**P < 0.01;F、G、H、I、J:M2 标志物(TGF-β、Ym、Arg1 、CD206、IL-10)的 mRNA 表达水平统计图,#P<0.05,##P<0.01,*P < 0.05,**P < 0.01。 
9.FTY720在体外细胞实验中对小胶质细胞培养上清液的炎性因子的影响
     采用ELISA法检测小胶质细胞上清液中的炎性细胞因子TNF-α,IL-1β,TGF-β,IL-13。以LPS+IFNγ+FTY720干预可以比LPS+IFNγ刺激组的炎性细胞因子TNF-α,IL-1β显著降低,炎性细胞因子TGF-β,IL-13显著增高,差异有统计学意义。结果提示FTY720可以减少炎性因子的释放,增多抗炎性因子的释放(Fig11)。
 
Fig10.在体外细胞实验中 FTY720干预后,小胶质细胞上清释放的炎性因子的改变A、B:促炎型因子TNF-α,IL-1β表达量的统计图,#P<0.05,##P<0.01,**P < 0.01;C、D:抗炎性因子TGF-β,IL-13表达量的统计图,##P<0.01,*P < 0.05,**P < 0.01。
10.FTY720与 LPS-INF-γ共刺激诱导小胶质细胞M2极化后的细胞上清促进少突胶质细胞前体细胞的分化
   以 LPS+IFN-γ或LPS+IFN-γ+FTY720或 LPS+IFN-γ刺激后再加入FTY720刺激或IL-4刺激原代小胶质细胞细24h 后收集上清,以这些条件上清处理少突胶质细胞前体细胞(OPCs),在体外检测FT720通过对小胶质细胞表型的转化对少突胶质前体细胞分化的影响。结果显示加入了M1(LPS+IFN-γ)+FTY720干预后的小胶质细胞条件培养基后的0PCs分化较用M1型小胶质细胞条件培养基干预的OPCs分化增多,提示FTY720通过促进M1型小胶质细胞向M2型小胶质细胞转化而促进OPCs的分化(Fig11)。
 
Fig11.在体外细胞实验中 FTY720干预后的小胶质细胞对OPCs分化成熟的影响A:MBP与Olig2免疫荧光双标染色代表图,scar bar,200µm;B:MBP与Olig2共标细胞数统计图,**P < 0.01,##P<0.01。
                           讨论
 随着当今社会老龄化的不断加剧,与年龄相关的缺血性脑白质损伤疾病的发病率不断增高。人脑白质约占全脑体积的50%[20],脑白质损伤是多种疾病的重要病理过程,如卒中、血管性痴呆、多发性硬化等[21]。而脑白质损伤是由于慢性低灌注引起的[22]。因此,要研究缺血性脑白质损伤需要建立一个可靠的慢性低灌注模型。
    芬戈莫德(FTY720),S1P受体激动剂,美国食品和药物管理局(FDA)2010年9月批准该药作为治疗多发性硬化的一线药物[23]。FTY720除了用于治疗多发性硬化外,Foster, C. A.等的研究发现在大鼠EAE模型中注射0.3mg/kg的FTY720可以在脑脊液中检测到高浓度的FTY720P[24],表明FTY720也可以调节S1P受体在少突胶质细胞、神经元、星形胶质细胞及小胶质细胞中的表达。在Kwon KJ等的研究中发现神经炎症是慢性脑灌注不足动物模型中白质损伤的关键病理过程[9]。在Meray Serdar等的研究中表明FTY720通过减少炎症和氧化应激,以及促进少突胶质前体细胞生长、成熟而改善高氧暴露新生儿大脑的脑白质结构及认知功能[25]。因此,FTY720可能对低灌注引起的缺血性脑白质损伤有保护作用且这种作用机制可能与抑制神经炎性有关,有广阔的应用前景。
    本研究采用低灌注导致的白质损伤模型-小鼠双侧颈总动脉狭窄(BCAS)模型,主要在于这种造模模型更加温和持久的降低脑血流,更好的模拟低灌注白质损伤。   
    Liesz 等的研究中曾报道在脑卒中模型中腹腔注射0.3mg/kg FTY720[24]。FTY720可以通过血脑屏障,可以直接影响中枢神经系统[26]。因此,本研究在BCAS术后,腹腔注射0.3mg/kg FTY720 3天、10天、一个月。大量研究发现,缺血性脑白质损伤以胶质细胞增生及髓鞘不同程度脱失为基本特点[6-8]。本研究LFB髓鞘染色结果显示FTY720治疗组小鼠可以减轻 BCAS 组小鼠在胼胝体中央区(CCm)、前联合(AC)、新纹状体(CPu)和内囊(IC)等区域中白质纤维束中的髓鞘脱失、白质纤维排列紊乱、空泡形成等白质损伤,且在胼胝体中央区最明显。利用Western blot技术检测小鼠 BCAS 术后 3 天、10 天、1 个月胼胝体中央区MBP及MAG的动态变化,结果显示与 FTY720干预组相比,Vehicle组MBP 蛋白表达量随着低灌注时间延长而表达逐渐降低,在1 个月时下降幅度最大,但尚无统计学意义;与此同时,与 FTY720干预组相比,Vehicle组MAG 从 BCAS 第 3 天起表达开始降低,在低灌注 1 个月时降至最低,并且降低趋势具有统计学意义。以上实验结果证实FTY720在小鼠低灌注损伤后可以减轻BCAS造模造成的白质区的髓鞘结构及完整性的损伤,减轻白质损伤。
   研究指出白质缺血对认知功能有影响[27]。本研究采用八臂迷宫行为学方法检测 BCAS术后1 个月的小鼠的认知功能,发现FTY720治疗组小鼠吃完八臂内食物的所有重复访问次数明显低于单纯BCAS造模组而高于假手术(Sham)组,前 8 次访问不同臂的个数多于单纯BCAS造模组而少于 Sham 组,提示FYY72治疗可以减少慢性低灌注造成的工作记忆错,减轻小鼠短时记忆受损;三组小鼠在完成固定臂内食饵任务时所犯错误没有明显差异,提示参考记忆错误无明显变化,BCAS术后小鼠长时记忆未见明显损伤。前额叶‐皮质下环路也许与工作记忆相关,BCAS模型降低脑白质区供血,促使白质区轴突-髓鞘结构的完整性受损害,从而使前额叶‐皮质下环路与深部白质长联系纤维等环路受损,信息传递发生障碍,导致工作记忆错误增多;而与参考记忆相关的是海马的完整性,三组小鼠相比BCAS术后小鼠没有明显的参考记忆错误,这说明BCAS模型选择性损伤白质区域。[28-32]。 
    小胶质细胞是中枢神经系统中定居的巨噬细胞,是对抗损伤的第一道防线[33-34]。小胶质细胞在中枢神经系统中调节免疫和炎症反应。在病理情况下,小胶质细胞分泌各种炎症因子,释放毒素,促使脑白质损伤。小胶质细胞存在两种极化状态[35-36],即经典(促炎,M1)型及替代(抗炎,M2)型[37]。而在以前的研究中,神经炎症被认为是慢性脑灌注不足动物模型中白质损伤的关键病理生理学[38],所以小胶质细胞在脑白质损伤中是一把双刃剑。有研究表明芬戈莫德(FTY720)通过防止淋巴细胞从淋巴结中排出而减少循环淋巴细胞的数量,并且可能有助于防止淋巴细胞早期浸润到脑中以及抑制小胶质细胞和巨噬细胞的局部活化。本研究通过免疫荧光染色及免疫磁珠分选流式检测的方法探讨FTY720在低灌注脑白质损伤后对小胶质细胞的影响,结果显示FTY720抑制低灌注后小胶质细胞的活化,小胶质细胞的M1型标志物减少而M2型标志物增多,表明FTY720促使小胶质细胞向M2型转化,减轻了神经炎症反应,对脑白质损害有保护作用。
    脑白质由一个复杂的结构单元构成,包括神经轴突、髓鞘及少突胶质细胞等。在脑缺血模型中,少突胶质细胞似乎极易因低血流量而受损[39]。脑白质缺血损伤后,产生大量炎性因子促进少突胶质细胞死亡,从而导致髓鞘脱失。同时,小胶质细胞分泌的细胞因子也会影响少突胶质细胞的发展[40]。小胶质细胞分泌的各种营养因子是影响少突胶质前体细胞存活、增殖、分化的重要因素[41]。研究表明,在EAE模型中,小胶质细胞激活促进了炎性因子的释放,抑制少突胶质细胞的存活与成熟[42]。本研究通过免疫荧光染色技术探讨FTY720在低灌注脑白质损伤后对少突胶质细胞生存、增殖、分化的影响,结果显示FTY720干预可显著减少低灌注后成熟少突胶质细胞的丢失及促进少突胶质细胞增殖分化。以上实验表明FTY720可以促使小胶质细胞向M2型转化,减少少突胶质细胞的丢失及促进少突胶质细胞增殖分化,从而减轻对脑白质的损害。但是这两者之间是否有关系尚不得知,而体内环境复杂,所以需要体外培养原代小胶质细胞和少突胶质前体细胞(OPCs)来探讨两者的关系及其相关机制。
     本研究通过体外培养原代小胶质细胞和少突胶质前体细胞(OPCs),通过LPS+IFN-γ刺激纯化后的小胶质细胞建立经典缺血性损伤模型,再用FTY720干预该模型,通过RT-PCR、Western blot技术检测小胶质细胞表型标记物,结果显示,FTY720干预后M1型小胶质细胞生物学标志物mRNA表达量及蛋白表达量减少,而M2型小胶质细胞生物学标志物mRNA表达量及蛋白表达量增高,提示FTY720干预可以促进M1型小胶质细胞向M2型小胶质细胞转化。采用ELISA法检测小胶质细胞上清液的炎性因子,结果显示FTY720干预后,炎性因子TNF-α,IL-1β的分泌减少,而TGF-β,IL-13的分泌增多。说明FTY720可以减少炎性因子的释放,增多抗炎性因子的释放。将小胶质细胞上清液加到纯化后的少突胶质前体细胞(OPCs)中,干预三天后采用免疫荧光染色方法探讨FTY720干预后小胶质细胞对少突胶质前体细胞的影响,结果显示FTY720干预后的小胶质细胞上清液促进少突胶质前体细胞(OPCs)的分化成熟。以上研究表明小胶质细胞的表型转化对少突胶质前体细胞(OPCs)的分化成熟有影响。但是关于其相关的机制还不明确,所以需要进一步实验探讨。
      本研究通过建立小鼠低灌注白质损伤模型,采用LFB染色法、Western blot技术以及免疫荧光染色、免疫磁珠分选流式检测的方法验证FTY720在小鼠低灌注损伤后可以减轻白质的损伤,对白质具有保护作用,并且验证了FTY720抑制低灌注后小胶质细胞的活化,促使小胶质细胞向M2型转化,减少少突胶质细胞的丢失及促进少突胶质细胞增殖分化。并通过体外培养原代小胶质细胞和OPCs探讨FTY720通过促进小胶质细胞向M2型转化而促进OPCs分化成熟,为低灌注白质损伤提供了新的研究思路和理论研究。
 
                   
 
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          综述: 小胶质细胞表型转化机制的研究
摘要
     小胶质细胞作为中枢神经系统的固有免疫细胞,是中枢神经系统的第一道防线。在特定的刺激下小胶质细胞可以被激活,活化的小胶质细胞可以表现为不同的极化表型,包括有害性的M1型及神经保护性的M2型,两种表型之间的平衡影响中枢神经系统疾病的进展。本文将综述小胶质细胞不同表型的功能,并围绕小胶质细胞两种表型相互转化的机制等问题展开探讨。
关键词:小胶质细胞的活化,M1型,M2型,表型相互转化机制
   小胶质细胞是中枢神经系统中定居的巨噬细胞,是对抗损伤的第一道防线[1-2]。小胶质细胞在中枢神经系统中调节免疫和炎症反应。对各种微环境信号,小胶质细胞可以表达特定的功能反应程序,连续存在两种极化状态[3-4]。小胶质细胞可以被极化为两种表型,即经典(促炎,M1)型及替代(抗炎,M2)型[5]。此外,小胶质细胞还有一个包含M1和M2表型标志物的中间表型[6],这表明了在小胶质细胞两种表型的交界处有促炎及抗炎两种机制存在。阐明小胶质细胞活化和分化的详细机制,将有助于驱动小胶质细胞从有害的表型转变为保护性的表型。本文将主要围绕小胶质细胞两种表型相互转化的机制展开讨论。
一.小胶质细胞简介:
    在19世纪后期,德国解剖学家弗朗茨尼氏首次描述了小胶质细胞并且因为它的杆状核而命名为Staebchenzellen (杆状细胞)。Nissl 解释说这些细胞具有神经胶质细胞迁移、吞噬及增殖的功能[7]。随后,在1913年西班牙神经学家Santiago Ramo´ny Cajal重新命名此类细胞为“第三种元素”,他指出这种细胞不同于神经元和星形胶质细胞,可能来源于中胚层。此外,“第三种元素”根据细胞形态及功能的不同分为各种细胞类型[8]。“第三种元素”的主要构成是少突胶质细胞,其次为小胶质细胞[9]。根据形态不同,小胶质细胞分为三种类型:阿米巴样、分枝状及中间型小胶质细胞[7]。从此,关于小胶质细胞的研究迅速广泛化[10]。
二.小胶质细胞的极化:
    最近的报告中概述的有益或有害的小胶质细胞的组织保护和修复的反应,表明小胶质细胞以发展成这两个不同的表型中的任意一个取决于特定的极化条件[11-12]。小胶质细胞表型的最主要的特点就是各种细胞表面受体及各种有特定功能的可溶性细胞因子等的表达及释放。在LPS和IFN--γ的刺激下,小胶质细胞可以极化M1型小胶质细胞(促炎型、经典激活型)。而在IL-4刺激下,小胶质细胞可以极化为M2型小胶质细胞(抗炎型、替代激活型)。M1型小胶质细胞可以分泌各种炎性因子,如IL-1b, IL-6, TNF-a, CCL2, 及 CXCL10,还可以分泌 ROS, NO和基质金属蛋白酶-9、基质金属蛋白酶-3[13-17]。 M1型小胶质细胞的功能是抗原提呈作用以及杀伤细胞内的病原体以维持环境稳态[18]。M2型小胶质细胞依据不同的刺激及功能可以分为三种亚型,即M2a、M2b、M2c型[19-21]。M2a型小胶质细胞由IL-4 或者 IL- 13刺激引起,主要可以抑制炎症反应。 Arginase-1, Ym1, IGF-1, CD206, chitinase 3-like 3 及 Fizz1在M2a型小胶质细胞中表达增高[20,22]。不同与 M2a型小胶质细胞,M2b型不表达Arginase-1, Ym1及Fizz1 ,而IL- 1RA, CD86, SOCS3 表达增高[23-24]。但是对M2b型小胶质细胞的了解较M2a型少。M2c型小胶质细胞可以被TGF-β, IL-10 及糖皮质激素诱导产生。M2c型小胶质细胞也被称为“无效的小胶质细胞”[22-23]。不是说没有功能,在炎症应答减弱时M2c型小胶质细胞有助于组织再生[24]。普遍认为M2型小胶质细胞有保护性功能,一项研究表明脊髓损伤用M2型小胶质细胞条件培养基治疗可以增强神经元存活[25]。大量研究表明促进M2型小胶质细胞极化有助于促进损伤后组织再生。
三.调控小胶质细胞表型转化的机制:
  小胶质细胞表型转化受到多条信号通路的介导及调控,包括转录因子,miRNA,干扰素调节因子(IRFs),MSX3,JAK-STAT,NF-кB,Notch信号通路等。
1.NF-кB,Notch信号通路
    NF-кB是转录因子蛋白家族,Cao等人研究发现各种炎性因子如趋化因子、细胞粘附因子、白介素等都受其调控[26]。Brifault等人最近发现的NF-кB和Notch/RBP-J信号通路调控小胶质细胞的表型转化[27]。NF-кB是一种典型的调控小胶质细胞表型向M1型转化的信号通路[28]。Notch 信号通路由 Notch 受体蛋白、Notch 配体蛋白和下游效应分子三部分组成。Notch 受体、配体在小胶质细胞均有表达,并发挥相应的功能Cao 等研究发现小胶质细胞活化后,Notch1 受体表达升高;而阻断Notch1后炎症因子IL-6、IL-1 及 iNOS 等的表达降低[26]。Liu HC等人的研究发现阻断小胶质细胞系N9细胞系后,M1型小胶质细胞的表达减弱,而M2型小胶质细胞的表达增高[34]。NF-кB和Notch信号通路是调控小胶质细胞表型转化的重要机制。
2.IRFs
    研究发现IRFs在不同病理生理条件下对神经胶质细胞及巨噬细胞的极化发挥着至关重要的作用[29-31]。各种IRF对小胶质细胞的极化发挥着不同的作用,如T. Satoh等研究发现IRF4调控小胶质细胞向M2型转化[32]。而研究发现IRF5可以诱导炎性因子产生,促使小胶质细胞向M1型转化[33];与之类似的T. Tanaka等研究发现在脊髓损伤中,IRF7在调控小胶质细胞向M1型的转化中起着关键性的作用[29]。IRF8不仅仅在调控小胶质细胞的活化中起着关键性作用,对小胶质细胞的形态、分子性质、体内稳态等也发挥着重要作用[34-35]。
3.miRNA
    最近研究发现非编码小RNA—microRNA (miRNA)对小胶质细胞和巨噬细胞的极化起着越来越重要的作用。miRNA的表达水平和小胶质细胞极化密切相关,例如miRNA155促进小胶质细胞向M1型转化,C.S. Moore等的研究发现miRNA155通过沉默mRNA转录因子M2型基因促进小胶质细胞向M1型转化[36]。而E.D. Ponomarev等研究发现miRNA124通过沉默mRNA转录因子M1型基因促进小胶质细胞向M2型转化[37]。
4.STATs
信号传导与转录激活因子(STAT)蛋白家族是一组可以被不同细胞因子受体激活的相关蛋白,在细胞因子—受体相互作用的过程中充当载体,保持信号在细胞内传递的内在特异性。最近的研究发现,STATs在调节小胶质细胞表型转化的过程中起着重要的作用。Antonia Cianciulli等人研究发现白藜芦醇预处理后,LPS激活的小胶质细胞产生的炎性因子 IL-1β, TNF-α和IL-6的表达量降低,而抗炎因子IL-10的表达增多;此外,白藜芦醇预处理上调JAK1和STAT3的表达,证明JAK-STAT信号通路参与了白藜芦醇的抗炎效应产生[38]。此研究发现STAT3在调节小胶质细胞向M2型转化过程中起着重要作用。Przanowski et 等研究发现敲除了STAT1和STAT3抑制了炎性因子的基因表达,而激活STAT1和STAT3表达诱发了炎性因子的表达,该研究发现 STAT1和STAT3是小胶质细胞炎性反应的一种机制[39]。
综上所述,小胶质细胞是中枢神经系统发挥免疫功能的固有细胞,而小胶质细胞的极化对于免疫功能的调节亦具有极为重要的意义,将这两个方向联系起来进行思考,研究小胶质细胞表型转化的机制对于整个中枢神经系统疾病深入认识有着重要价值,为中枢神经系统疾病的治疗提供了新的靶点。
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                         缩略词表 
                (Abbreviations)
简称 英文全称 中文全称
BCAS bilateral common carotid artery stenosis 双侧颈总动脉狭窄
OPC Oligodendrocyte precurosor cell 少突胶质前体细胞
LFB Luxol fast blue staining 固蓝染色 
NF-200 neurofilament -200 神经纤维重链
Cy3 Cyanine-3 青色素3
FITC Fluorescein isothiocyanate 异硫氰酸荧光素
DAPI 4',6-diamidino-2-phenylindole 4',6二脒基-2-苯吲哚盐酸
ECL Enhanced Chemiluminescence 增强化学发光
BSA Bovine serum albumin 牛血清白蛋白
SDS sodium dodecyl sulfate 十二烷基硫酸钠
PAGE polyacrylamide gel electrophoresis 聚丙烯酰胺凝胶电泳
TBS Thermonorphic biphasic amine solvent 叔丁基二甲基硅烷
rpm revolutions per minute 每分钟转数
PBS PhosPhate buffered saline 磷酸盐缓冲液
BrdU bromodeoxyuridine 溴脱氧尿苷 
TUNEL Terminal-deoxynucleoitidyl Transferase Mediated Nick End Labeling 末端标记法